疏風止咳提取物質量標準研究

武琳 楊光

摘要：目的 建立疏風止咳提取物的質量標準，提高其質量可控性，保證成品藥效。方法 采用HPLC同時對疏風止咳提取物中白芍、防風、虎杖、甘草、射干和北柴胡進行專屬性鑒別，色譜柱為Phenomenex Kintex C18（4.6 mm×100 mm，2.6 ?m），流動相為乙腈-0.05%磷酸，梯度洗脫（0～25 min，10%乙腈；25～26 min，10%→14%乙腈；26～35 min，14%乙腈；35～36 min，14%→34%乙腈；36～55 min，34%乙腈），柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長250 nm。采用HPLC同時測定疏風止咳提取物中芍藥苷和升麻素苷含量。色譜柱為Phenomenex Luna C18（4.6 mm×150 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.05%磷酸（12∶88），柱溫40 ℃，流速1 mL/min，檢測波長250 nm。結果 疏風止咳提取物中白芍、防風、虎杖、甘草、射干和北柴胡HPLC色譜峰分離度好且陰性無干擾。芍藥苷在0.035 93～2.514 8 ?g范圍內線性關系良好（r=0.999 5），平均加樣回收率為100.54%（n=6）；升麻素苷在0.006 7～0.67 ?g范圍內線性關系良好（r=0.999 5），平均加樣回收率為100.39%（n=6）。結論 本研究建立的質量標準簡便、可靠、準確，可快速鑒別疏風止咳提取物中白芍、防風、虎杖、甘草、射干和北柴胡，快速測定芍藥苷和升麻素苷含量，為控制疏風止咳提取物的質量提供依據。

關鍵詞：疏風止咳提取物；高效液相色譜法；芍藥苷；升麻素苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.020

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）03-0082-05

Study on Quality Standards for Shufeng Zhike Extract WU Lin， YANG Guang （Beijing Zhongyan Tongrentang Chinese Medicine R&D; Co. LTD.， Beijing 100075， China）

Abstract： Objective To establish the quality standards for Shufeng Zhike Extract； To improve the controll ability of the extract and ensure medicine efficacy. Methods To establish a HPLC method for simultaneous differentiation of Paeoniae Radix Alba， Saposhnikoviae Radix， Polygoni Cuspidati Rhizomaet Radix， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Bupleurum in Shufeng Zhike Extract. Phenomenex Kintex C18 column （4.6 mm×100 mm， 2.6 ?m） was used. Acetonitrile-0.05% phosphoric acid was as the mobile phase in gradient elution （0–25 min， 10% acetonitrile； 25–26 min， 10%→14% acetonitrile； 26–35 min， 14% acetonitrile； 35–36 min， 14%→34% acetonitrile； 36–55 min， 34% acetonitrile） at flow rate of 0.8 mL/min， and column temperature was 40 ℃. The detection wavelength was 250 nm. To establish a HPLC method for simultaneous determination of Paeoniflorin and Prim-O-glucosylcimifugin in Shufeng Zhike Extract， Phenomenex Luna C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 ?m） was used； acetonitrile-0.05% phosphoric acid （12：88） was as the mobile phase at flow rate of 1 mL/min； column temperature was 40 ℃； the detection wavelength was 250 nm. Results The chromatographic peak separation with HPLC method for simultaneous differentiate of Paeoniae Radix Alba， Saposhnikoviae Radix， Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Bupleurumin in Shufeng Zhike Extract was clear and negative control had no interference. The linear range of Paeoniflorin was 0.035 93–2.514 8 ?g （r=0.999 5）， and the average recovery was 100.54% （n=6）. The linear range of Prim-O-glucosylcimifugin was 0.006 7–0.67 ?g （r=0.999 5）， and the average recovery was 100.39% （n=6）. Conclusion The established quality standards are simple， reliable， and accurate. It can rapidly identificate Paeoniae Radix Alba， Saposhnikoviae Radix， Polygoni Cuspidati Rhizomaet Radix， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Bupleurum， and suitable for rapid determination of Paeoniflorin and Prim-O-glucosylcimifugin， which can provide the basis for the quality inspection of Shufeng Zhike Extract.

Key words： Shufeng Zhike Extract； HPLC； Paeoniflorin； Prim-O-glucosylcimifugin

通訊作者：楊光，E-mail：y2000g@263.net

疏風止咳顆粒為北京中研同仁堂醫藥研發有限公司研發的中藥六類復方新藥，其功能主治為疏風宣肺、止咳化痰、解痙平喘。疏風止咳顆粒由白芍、防風、柴胡、射干、虎杖、甘草及苦杏仁等12味藥組成，其提取物的制法為以上12味藥加水煎煮2次，合并濾液，過濾，濃縮，制成干膏粉。在以往的文獻資料中，關于單味藥材提取物的質量標準研究較多，而復方制劑提取物的質量標準研究較少。本研究注重復方制劑提取物的質量標準研究，建立HPLC同時對疏風止咳提取物中白芍、防風、虎杖、甘草、射干和北柴胡藥材的專屬性鑒別方法，及HPLC同時測定疏風止咳提取物中芍藥苷和升麻素苷含量的方法，為控制該提取物的質量提供依據，同時為工藝條件篩選提供可靠準確的數據支持，以保證藥物療效。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（DAD二極管陣列檢測器），METTLER TOLEDO XP205型電子分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司），KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率40 kHz）。

虎杖苷對照品（供含量測定用，批號111575- 200301）、甘草苷對照品（供含量測定用，批號111610- 201106，含量以93.7%計）、射干苷對照品（供含量測定用，批號111632-200501）、甘草酸銨對照品（供含量測定用，批號110731-201116，含量以93.1%計）、芍藥苷對照品（供含量測定用，批號110736-200934，含量以95.7%計）、升麻素苷對照品（供含量測定用，批號1522-200203），中國食品藥品檢定研究院；柴胡皂苷B2對照品（供含量測定用，批號ES-110928，純度≥98%），上海億欣生物技術有限公司；疏風止咳提取物，北京中研同仁堂醫藥研發有限公司提供（批號20120331、sf01、sf02、sf03、sf04、sf05、sf06、sf07、sf08、sf09）；配制標準溶液及供試品溶液的試劑均為分析純，液相色譜用試劑為高效液相級，液相用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜鑒別

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Kintex C18（4.6 mm×100 mm，2.6 ?m）；流動相A為乙腈，B為0.05%磷酸，梯度洗脫程序見表1；流速0.8 mL/min；檢測波長250 nm；柱溫40 ℃。理論板數按芍藥苷峰和升麻素苷峰計算分別應不低于2500。

表1 流動相梯度洗脫條件（%）

時間 A B

0～25 min 10 90

25～26 min 10→14 90→86

26～35 min 14 86

35～36 min 14→34 86→66

36～54.5 min 34 66

54.5～55 min 34→10 66→90

55～60 min 10 90

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品、升麻素苷對照品、虎杖苷對照品、甘草苷對照品、射干苷對照品、甘草酸銨對照品、柴胡皂苷B2對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含芍藥苷150 ?g、升麻素苷30 ?g、虎杖苷130 ?g、甘草苷30 ?g、射干苷25 ?g、甘草酸銨30 ?g和柴胡皂苷B2 25 ?g的混合溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品1 g，研細，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，搖勻，過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例分別取不含白芍、防風、虎杖、甘草、射干和柴胡的其余飲片，按其工藝制成空白制劑，按“2.1.3”項下方法制備，即得。

2.1.5 空白干擾試驗 精密吸取供試品溶液，芍藥苷、升麻素苷、虎杖苷、甘草苷、射干苷、甘草酸銨、柴胡皂苷B2的混合對照品溶液，白芍陰性對照溶液，防風陰性對照溶液，虎杖陰性對照溶液，甘草陰性對照溶液，射干陰性對照溶液和柴胡陰性對照溶液各5 ?L，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，記錄色譜圖。結果在供試品色譜中呈現與對照品芍藥苷、升麻素苷、虎杖苷、甘草苷、射干苷、甘草酸銨、柴胡皂苷B2色譜峰保留時間相同的色譜峰。白芍陰性對照溶液在與芍藥苷對照品相同保留時間處未顯色譜峰，防風陰性對照溶液在與升麻素苷對照品相同保留時間處未顯色譜峰，虎杖陰性對照溶液在與虎杖苷對照品相同保留時間處未顯色譜峰，甘草陰性對照溶液在與甘草苷和甘草酸銨對照品相同保留時間處未顯色譜峰，射干陰性對照溶液在與射干苷對照品相同保留時間處未顯色譜峰，柴胡陰性對照溶液在與柴胡皂苷B2對照品相同保留時間處未顯色譜峰，故認為空白無干擾。色譜圖見圖1。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18（4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流動相：乙腈-0.05%磷酸（12∶88）；流速：1 mL/min；檢測波長：250 nm；柱溫：40 ℃。理論板數按芍藥苷峰和升麻素苷峰計算分別應不低于2500。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品和升麻素苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含0.15 mg和30 ?g的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研成細粉，取約1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例分別取不含炒白芍藥材和防風藥材的其余藥材，按其工藝制成空白制劑，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.2.5 空白干擾試驗 精密吸取供試品溶液、芍藥苷和升麻素苷混合對照品溶液、炒白芍陰性對照溶液和防風陰性對照溶液各5 ?L，在上述色譜條件下進樣，記錄色譜圖。結果芍藥苷和升麻素苷可與其他成分基線分離，炒白芍陰性對照溶液在與芍藥苷對照品相同保留時間處未顯色譜峰，防風陰性對照溶液在與升麻素苷對照品相同保留時間處未顯色譜峰，故認為空白無干擾。色譜圖見圖2。

2.2.6 線性關系考察 分別精密吸取芍藥苷對照品溶液（0.375 4 mg/mL，含量以95.7%計）0.1、0.2、0.3、0.5、1、3、5、6、7 ?L注入液相色譜儀，測得峰面積，以對照品進樣量（?g）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明芍藥苷在0.035 93～2.514 8 ?g范圍內進樣量與峰面積呈良好的線性關系?；貧w方程為Y=309.5X+3.991，r=0.999 5，可用外標一點法計算。

分別精密吸取升麻素苷對照品溶液（0.134 mg/mL）0.05、0.2、0.3、0.4、0.5、2、3、5 ?L注入液相色譜儀，測得峰面積。以對照品進樣量（?g）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明升麻素苷在0.006 7～0.67 ?g范圍內進樣量與峰面積呈良好的線性關系?；貧w方程為Y=1854X+2.723，r=0.999 5，可用外標一點法計算。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液，連續進樣6次測定。芍藥苷含量平均值為4.086 5 mg/g，RSD=0.48%；升麻素苷含量平均值為0.415 5 mg/g，RSD=1.71%。表明精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定。芍藥苷含量平均值為4.130 3 mg/g，RSD=1.01%；升麻素苷含量平均值為0.410 7 mg/g，RSD=1.77%。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.9 重復性試驗 精密稱取同一批疏風止咳提取物樣品（批號20120331）6份，分別按“2.2.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定。芍藥苷含量平均值為4.254 2 mg/g，RSD=1.79%；升麻素苷含量平均值為0.414 4 mg/g，RSD=0.91%。表明本方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品（批號20120331，含芍藥苷4.254 2 mg/g、升麻素苷0.414 4 mg/g）6份，每份約0.5 g，分別精密加入芍藥苷對照品（0.087 8 mg/mL，含量以95.7%計）和升麻素苷對照品（8.04 ?g/mL）混合溶液25 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定。結果芍藥苷平均回收率為100.54%（n=6），RSD=2.83%；升麻素苷平均回收率為100.39%（n=6），RSD=2.69%。見表2、表3。

2.2.11 樣品含量測定 取10批疏風止咳提取物，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，每批樣品測定3次，結果見表4。

3 討論

本研究曾分別建立疏風止咳提取物中虎杖苷、射干苷、柴胡皂苷B2的含量測定方法，疏風止咳提取物的HPLC鑒別方法是在虎杖苷、射干苷、柴胡皂苷B2含量測定方法的基礎上建立的。通過考察檢測波長207、220、237、250、254 nm條件下的色譜圖，結果發現波長為250 nm時，樣品中各被檢測的峰響應值適合，且陰性無干擾，故選擇檢測波長為250 nm。在試驗中發現提高柱溫后，被檢測峰之間的分離度較好，同時可以改善峰型，故柱溫選用40 ℃。

本研究實現了HPLC同時鑒別白芍、防風、虎杖、甘草、射干和北柴胡藥材，為建立特征圖譜或指紋圖譜奠定了基礎。該法與薄層色譜鑒別法相比，供試品制備操作簡便，方法快速，有毒試劑用量少。

白芍中芍藥苷和防風中升麻素苷的含量測定方法較多[1-4]，本研究選擇HPLC。在建立該提取物芍藥苷和升麻素苷含量測定方法時[5]，對流動相進行了選擇，結果發現乙腈-0.05%磷酸（12∶88）作為流動相時所得芍藥苷與升麻素苷分離度好，峰型好且陰性無干擾。不同批號疏風止咳提取物中芍藥苷和升麻素苷含量相差較遠，分析原因可能是不同批號炒白芍飲片和防風飲片中的芍藥苷和升麻素苷含量差異所導致，提示生產中應控制炒白芍飲片和防風飲片中的芍藥苷和升麻素苷含量。

本研究在試驗中取芍藥苷對照品加甲醇溶解，注入液相色譜儀，用二極管陣列檢測器進行紫外全波長掃描（200～400 nm），結果芍藥苷在230 nm附近有最大吸收峰，但供試品色譜圖中，檢測波長為230 nm時芍藥苷峰處有干擾，查看干擾峰的全波長掃描圖，發現干擾峰在250 nm處有最小吸收峰，故比較檢測波長為230 nm和250 nm時干擾峰對芍藥苷峰的影響，結果發現檢測波長為250 nm時，供試品色譜圖中芍藥苷峰處無干擾，故選擇檢測波長為250 nm。

本研究建立了HPLC同時對疏風止咳提取物中白芍、防風、虎杖、甘草、射干和北柴胡藥材的專屬性鑒別方法，該法充分體現了專屬性鑒別和多成分、整體質量控制的理念。建立的HPLC同時測定疏風止咳提取物中的芍藥苷和升麻素苷含量的方法，操作簡便，實用性強，重復性好，可快速準確測定疏風止咳提取物中芍藥苷和升麻素苷的含量，可用于控制疏風止咳提取物的質量，為工藝條件篩選提供可靠的數據支持，以保證藥物療效。

參考文獻：

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[4] 陳靜，李正杰，張彥芬，等.HPLC法測定痛泄膠囊中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、芍藥苷含量[J].中醫藥信息，2011，28（4）：35-37.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：96-97.

（收稿日期：2016-01-07）

（修回日期：2016-07-04；編輯：陳靜）