光動力學療法對瘢痕成纖維細胞中轉化生長因子β1的作用

蔡 宏，王毅俠，李 鈾，劉 瑋，孫 平，董 寧

光動力學療法對瘢痕成纖維細胞中轉化生長因子β1的作用

蔡 宏1，王毅俠1，李 鈾1，劉 瑋1，孫 平1，董 寧2

(1.解放軍空軍總醫院皮膚科 北京 100142; 2.解放軍總醫院第一附屬醫院燒傷研究所 北京 100037 )

目的：探討光動力學療法（Photodynamic therapy, PDT）對體外培養瘢痕成纖維細胞（hypertrophic scar fibroblast，HSF）中轉化生長因子β1的影響。方法：將原代培養的HSF分為對照組、HMME-PDT組、單純光敏劑組和單純激光照射組，用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測PDT后HSF分泌至上清液的TGF-β1蛋白表達量，應用Western-Blot觀察PDT對細胞漿內轉化生長因子β1的作用。結果：HSF分泌至細胞上清液的TGF-β1蛋白含量較高，而HMME-PDT后降低；HSF合成的TGF-β1蛋白水平高，HMME-PDT后HSF中的TGF-β1蛋白含量減少。結論：HMME-PDT能夠阻止TGF-β1的信號傳向細胞核，改變TGF-β1在HSF細胞水平的表達，使細胞核內細胞增殖及膠原合成有關的靶基因得不到激活，從而抑制HSF增殖。

光動力學療法；激光；光敏劑；瘢痕成纖維細胞；轉化生長因子β1

血卟啉單甲醚（Hematoporphyrin Monomethyl Ether, HMME）－光動力學療法（Photodynamic therapy, PDT）可以抑制體外培養HSF的增殖，但是，對于該作用機制尚未闡明。HSF作為創傷修復過程中重要的功能細胞和HS組織中主要的細胞成分，其分泌的多種細胞因子對HS的形成和發展有著重要影響。

目前的研究表明，創傷愈合過程中，生長因子的持續刺激作用是導致HS形成的重要原因[1]。轉化生長因子β（transforming growth factor-beta, TGF-β）具有調節細胞增殖、促進細胞外基質的產生、調控細胞的粘附和游走性等功能，它在創傷愈合過程中的效應取決于自身特性、濃度、靶細胞的種類和特性等。在TGF-β超家族中，TGF-β1是與瘢痕過度形成關系最為密切的細胞因子[2]。雖然TGF-β1對成纖維細胞的影響可能是正向的，也可能是負向的，但就總體而言，特別是從大量實驗研究和臨床實踐表明，TGF-β1是促進HS發生的重要因子。本研究檢測了HSF在經過HMME-PDT照射后TGF-β1蛋白的表達情況，并探討了其與HSF增殖的關系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗標本來源：本實驗所有標本均取自解放軍總醫院第一附屬醫院燒傷整形科的HS患者，取材經患者本人同意，HS患者共10例，男8例，女2例，年齡15～25歲，病變部位為前胸、背部，均處于增生期，此前未接受過其它治療，均經臨床及病理證實診斷。

1.1.2 實驗試劑和儀器：HMME（上海第二軍醫大學研制，批號031209）；人轉化生長因子定量酶聯檢測試劑盒（上海森雄科技公司）；TGFβ1單克隆抗體、FITC標記羊抗鼠/兔IgG（北京中杉金橋生物技術公司）；蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）；630nm半導體紅光激光器（桂林興達光電醫療器械有限公司）；LM－93II型激光功率計（中國計量院）；Olympus-BH2型生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代培養：將手術切除的瘢痕組織，在無菌條件下剪成0.5～1.0cm3的小塊，立即投入含100U/ml青、鏈霉素的培養液中。剪除脂肪、表皮及結締組織，D-Hanks液清洗至無油滴，反復剪碎至小于1mm3的小塊，按適當間隔接種于培養瓶壁上，反轉使有組織塊的一面向上，加入含15%FBS的F12/DMEM培養基3ml，置37℃、5% CO2孵箱中孵育4h后，輕輕倒轉，使培養液浸沒組織塊，待培養液變黃后更換。4～10d組織塊周圍萌出細胞并逐漸形成細胞暈，20～30d細胞長滿瓶，形成細胞單層。

1.2.2 傳代培養：用0.25%胰酶消化，吹打，制成單細胞懸液。按1∶2比例傳代，建立HSF的傳代細胞系，實驗用第4～6代細胞，待細胞70%～80%融合時用于后續實驗。

1.2.3 PDT處理和實驗分組：培養的HSF與4μg/ml的HMME避光孵育4h后行PDT處理。照射波長為630nm，調整功率密度至10mW/cm2，能量密度2.5J/cm2；照光前后均監測輸出功率，輸出功率波動范圍＜±5%；PDT后繼續將細胞放回孵箱中孵育20h，再進行下一步實驗檢測。其中，對照組不給予光敏劑和照光處理。并設立單純光敏劑組（PS：4μg/ml HMME）和單純激光照射組（Laser：波長630nm，功率密度10mW/cm2，能量密度2.5J/cm2）。

1.2.4 ELISA法檢測HSF分泌TGF-β1蛋白水平：檢測步驟按試劑盒說明書進行，試劑盒的敏感性小于16pg/ml。建立標準曲線孔后，在待測品孔中加入已激活的標本，每組每次4孔，重復3次。將反應板置于37℃孵育120min，洗板后加入第一抗工作液，繼續37℃孵育60min。洗板后加入酶標抗體工作液，37℃孵育60min，再次洗板并加入底物工作液，置37℃反應5～10min后，加入終止液終止反應，在酶聯儀上492nm處測定吸光值。根據樣品OD值在標準曲線上查出TGF-β1蛋白含量，并依據最初稀釋比例計算TGF-β1蛋白濃度值。

1.2.5 蛋白的提取及Western-blot分析：應用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，12 000g離心15min，將上清轉管后于-80℃凍存。在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，上樣量為30μg總蛋白。電泳完畢后，使用電轉移儀將樣品轉移至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉PBS液室溫封閉1h，在封閉液中分別加入兔抗人Smad3 mAb、磷酸化Smad3 mAb（1:1000）4℃過夜。TBST漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（稀釋比例為1:1000）。在暗室中，采用化學發光反應試劑盒進行檢測。

1.2.6 統計學方法：數據以均數±標準差(xˉ±s)表示，采用Chiss軟件進行統計分析，行配對t檢驗，P＜0.05時差異有顯著意義。

2 結果

2.1 HMME-PDT對瘢痕成纖維細胞分泌TGF-β1的影響：經過5次重復實驗后，得出HSF對照組中細胞分泌至培養上清中的TGF-β1蛋白為（64.56±14.46）ng/ml，即表示HSF分泌至細胞外的TGF-β1蛋白含量較高。HMME-PDT治療組為（23.94±8.55）ng/ml，與對照組相比，其分泌量顯著降低，二者相比具有統計學差異（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 HMME-PDT對瘢痕成纖維細胞分泌TGF-β1的影響（n=12）

2.2 HMME-PDT對HSF中TGF-β1的影響：與對照組相比，Western-blot結果表明HMME-PDT治療后HSF中TGF-β1蛋白含量減少（0.97±0.12 VS 0.28±0.02, P＜0.05），PS組和Laser組中TGF-β1蛋白表達無顯著改變（0.97±0.12 VS 0.82±0.14, P＞0.05；0.97±0.12 VS 0.86±0.17, P＞0.05）。

3 討論

HS是外傷、燒傷、感染或其它真皮損傷所導致的以膠原等大量結締組織基質的過度產生和沉積為特征的皮膚纖維化疾病。大量研究表明[3]，TGF-β1表達增加與瘢痕的過度形成密切相關，當TGF-β1失去調節，持續過表達就會導致皮膚及臟器的纖維化疾病，如硬皮病，肺纖維化以及HS，甚至瘢痕疙瘩等。

TGF-β1是迄今為止人們了解最多、與創傷愈合和瘢痕形成以及多種纖維化疾病關系最密切的細胞因子之一，它還是成纖維細胞和單核細胞的有效趨化劑，是影響創面愈合及HS形成的最重要的生長因子。研究表明在裸鼠皮下注射TGF-β1可致注射局部纖維化，而全身應用可致機體主要臟器（如肺、肝、腎等）纖維化[4]。硬皮病、肺纖維化及HS等纖維化疾病患者可以檢測到病變部位TGF-β1表達增強，這可能是由于TGF-β1促進成纖維細胞合成ECM，抑制膠原酶和纖溶酶原激活物的表達，增加膠原酶抑制物—金屬蛋白酶抑制劑（Tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）、纖溶酶原激活物抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor 1, PAI-1）的產生，拮抗某些細胞因子的致絲裂作用等[5]。

圖2 HMME-PDT對HSF中TGF-β1/Smads信號傳導蛋白的影響

本實驗結果表明，HMME-PDT抑制體外培養的HSF合成并分泌TGF-β1蛋白。由于TGF-β超家族成員通過膜綁定異側的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體復合體傳遞信號，所以在配體綁定后，受體激活進而導致胞質Smad家族蛋白底物磷酸化[6]。TGF-β1誘導的信號轉導通路可以分為細胞外和細胞內信號轉導兩相，其信號轉導的調控也就體現在不同的水平之上。細胞外部分，包括配體的程序性激活和可控性擴散、配體-受體復合物形成等；細胞內部分由于涉及到細胞信號網絡，相對比較復雜，不僅有TGF-β1自身信號轉導通路每個環節的調控，也同時存在其它信號轉導通路的交叉調節，以及各個通路之間的整合或互相拮抗。因此，TGF-β1信號轉導調控系統是復雜而精密的。正是由于有如此精密的調控系統的存在，才使得TGF-β1能在不同環境下發揮它的多種功能，產生各種效應。

正常成纖維細胞合成TGF-β1后并非直接分泌到細胞外發揮功能，而是與特定的蛋白質相互作用形成復合體，以較大的前體形式存在于細胞中[7]。這些蛋白質包括：LAP（Latency associated peptide, LAP）、LTBP（Latent TGF-β1binding protein）等。它們在復合體中能夠幫助TGF-β1的正確折疊并保持其穩定性，并使其易于分泌。本實驗采用ELISA方法檢測HSF分泌到細胞外的TGF-β1水平，表明HSF分泌較多的TGF-β1，這與上述HSF的高代謝、高分泌狀態相一致。

Heckenkamp等[8]在抑制靜脈血管再狹窄的研究中發現，PDT治療后第3和第7天，成纖維細胞的增殖能力分別減少了30%和76%，其所分泌的細胞外基質也分別減少了47%和51%，并推測該效應的產生與TGF-β1mRNA的表達顯著降低密切相關。Gold等[9]已證實TGF-β1能夠在成纖維細胞中大量表達，提示瘢痕形成涉及成纖維細胞向TGF-β1的高敏性轉換和積累，并且這類高敏的成纖維細胞未能及時消亡而且仍然分泌TGF-β1形成正反饋。所以，通過各種方法下調或對抗TGF-β1是目前防治瘢痕的方向之一。

研究表明[10]HMME的主要成分為相對疏水性卟啉，易結合于細胞的內質網、高爾基體、溶酶體等膜性結構。HSF細胞內的內質網豐富，高爾基體發達，以及線粒體數目大量增加，HMME進入HSF后以這些細胞器為主要分布位點，經激光照射產生反應活性很高的自由基和單線態氧等ROS，導致亞細胞水平多位點損傷。由于蛋白合成的場所——粗面內質網和核糖體受PDT損傷，從而抑制了細胞合成與分泌TGF-β1等蛋白的能力。本實驗結果亦表明HMME-PDT能夠抑制HSF分泌TGF-β1，其表達水平顯著降低。本實驗采用ELISA的方法檢測到，HMME-PDT組HSF分泌TGF-β1蛋白減少，故筆者推測正是由于HMME-PDT阻滯細胞的高增殖和高分化，導致其自身合成TGF-β1蛋白的能力下降，遞呈給TβRⅠ的信息減少，進一步抑制HSF的增殖。此外，由于HMME易于在細胞膜性細胞器積聚，故推測細胞膜必然也是HMME結合和積聚的位點。經PDT治療后必然會損傷細胞膜，分布于細胞膜上的TGF-βR功能亦受損，影響細胞外信號TGF-β1向細胞內有效傳導。

HS的攣縮影響皮膚的正常外觀和功能，在攣縮過程中HSF向肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）分化，它是成纖維細胞在創傷愈合或攣縮過程中的一種終極表型，Adam等在α-SMA基因啟動子序列中發現了一個TGF-β1調控位點（TGF-β1Control Element，TCE），提出TGF-β1本身可以直接參與到MFB的分化，并認為除了TCE外，TGF-β1還作用于內源性的CArG[CC(A/T)6GG]控制元件調控成纖維細胞的分化。研究發現[11-12]，抗體靶向光分解(antibodytargeted photolysis, ATPL)對于體外控制FPCLs收縮是一種具有高選擇性和有效的方法，通過改變光敏劑和光劑量等PDT參數，能減少FPCLs的收縮程度，為調控細胞外基質的產生提供可能。本實驗的研究結果表明，HMME-PDT抑制體外培養的HSF自分泌和合成TGF-β1蛋白，終而可能會通過TCE或其它相關控制元件影響MFB的分化和α-SMA蛋白的表達，發揮抑制瘢痕攣縮的作用。

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The Investigation of Transforming Growth Factor β1in HSF after HMME-PDT

CAI Hong1,WANG Yi-xia1,LI You1,LIU Wei1,SUN Ping1,DONG Ning2
(1.Department of Dermatology, The General Hospital of Air Force, Beijing 100142, China;2. Burns Institute, the First Hospital Affiliated to the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100037,China)

ObjectiveTo investigate the response of TGF-β1after PDT which induced by hematoporphyrin monomerthyl ether (HMME) in human fibroblasts from hypertrophic scar (HSF).MethodsFibroblasts were cultured from nontreated hypertrophic scars, and cells were divided into 4 groups: control (untreated), HMME-PDT, HMME and Laser. The expression of TGF-β1in supernatant of HSF was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of TGF-β1was analyzed by Western blot.ResultsHMME-PDT down-regulated the protein level of TGF-β1both in supernatant of HSF and in HSF.ConclusionHMME-PDT decreased TGF-β1activation. It inhibited the proliferation of HSF through decreased the activation of taget gene.

Photodynamic therapy; laser; Photosensitizer; hypertrophic scar fibroblast; TGF-β1

R619+.6

A

1008-6455（2017）02-0005-04

2016-07-19

2016-11-23

編輯/張惠娟

本研究受國家自然科學基金資助（光動力學療法作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞 TGF-β1/Smad3 信號通路的分子機制：編號81301386）

劉瑋，教授，主任醫師，地址：北京海淀區阜成路30號，郵編：100142；E-mail：lwei5811@126.com