鈣離子對(duì)小鼠肝臟鐵調(diào)素表達(dá)的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制

雷宇華 呂雨虹 劉 麗 李菁菁 常彥忠

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017)

鈣離子對(duì)小鼠肝臟鐵調(diào)素表達(dá)的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制

雷宇華 呂雨虹 劉 麗 李菁菁 常彥忠1

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017)

目的 探討鈣離子對(duì)小鼠肝臟鐵調(diào)素(hepcidin)mRNA表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分3組，對(duì)照組腹腔注射0.9%生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射CaCl2溶液(140 mg/kg)，注射0、6、24 h后分別取材。試劑盒檢測(cè)血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度，RT-PCR檢測(cè)肝臟hepcidin mRNA表達(dá)，Western印跡檢測(cè)脾臟Fpn1蛋白和肝臟中幾個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)。結(jié)果 相對(duì)于對(duì)照組，小鼠腹腔注射CaCl2溶液6、24 h后血清鐵明顯下降(P<0.05)，肝臟中hepcidin mRNA表達(dá)在6 h下降顯著(P<0.05)，F(xiàn)pn1蛋白表達(dá)上升，p-SMAD蛋白在6 h略有下降，而p-STAT蛋白在6 h后下降明顯。結(jié)論 SMAD、STAT信號(hào)分子參與了鈣離子對(duì)小鼠肝臟hepcidin mRNA的表達(dá)。

鈣離子；鐵調(diào)素(hepcidin)；Fpn1；鐵代謝

鐵是人體內(nèi)必需的微量元素，參與許多重要的生命過(guò)程。鈣和鐵一樣為機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素，參與骨骼構(gòu)成、肌肉收縮運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)遞質(zhì)和激素的合成釋放等生理過(guò)程。在地中海貧血和遺傳性血色病等鐵過(guò)載疾病中，還伴隨一系列骨病發(fā)生，包括軟骨病、骨質(zhì)疏松等〔1,2〕。這些研究暗示機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)和鈣在代謝上具有密切的相關(guān)性。本研究主要通過(guò)檢測(cè)腹腔注射CaCl2后小鼠肝臟鐵調(diào)素(hepcidin)和相關(guān)信號(hào)蛋白的變化，以確定鈣對(duì)小鼠鐵代謝的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 3月齡昆明雄性小鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物養(yǎng)殖中心。選用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物干飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，自由飲水正常光照，環(huán)境溫度22℃～24℃，相對(duì)濕度為45%～55%。Trizol、RNasin、dNTP、Random Primer、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶等購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；血清鐵測(cè)定試劑盒和血清總鐵結(jié)合力試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；Fpn1抗體購(gòu)自美國(guó)Alpha Diagnostic；β-actin抗體購(gòu)自Sigma；p-SMAD、p-STAT3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling。

1.2 動(dòng)物處理和取材 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分3組，每組6只。對(duì)照組腹腔注射0.9%生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射CaCl2溶液(140 mg/kg)，注射0、6、24 h后分別取材。小鼠用0.4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死，用EP管收集全血，靜止過(guò)夜后，1 000 r/min，4℃離心20 min取上清，以備血清鐵等各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。0.9%生理鹽水灌流后取肝臟、脾臟備用。

1.3 血清鐵和總鐵結(jié)合力測(cè)定 使用南京建成科技有限公司的試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)完成。

1.4 RT-PCR檢測(cè) 取適量小鼠肝臟和脾臟組織加入Trizol溶液勻漿，然后經(jīng)過(guò)氯仿分層、異丙醇沉淀和乙醇洗滌并晾干后加入DEPC處理的去離子水溶解，測(cè)定濃度并計(jì)算加樣量，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)掃描并計(jì)算吸光度值。實(shí)驗(yàn)中小鼠目的基因的PCR引物均為上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列：hepcidin的基因HAMP1：正義鏈CCTATCTCCATCAACAGATG；反義鏈AACAGATACCACACTGGGAA；β-actin：正義鏈AGCCATGTACGTAGCCATCC；反義鏈TTTGAGGTCACGCACGATTT。

1.5 組織蛋白提取和Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 取肝臟和脾臟組織，加蛋白裂解液提取組織總蛋白。蛋白定量后采用SDS-PAGE電泳(10%的分離膠)，將凝膠蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，TBS洗膜3次，加入5%奶粉封閉2 h。與1∶1 000的一抗4℃孵育過(guò)夜。TBS洗膜3次，1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。TBS洗膜3次后加入ECL發(fā)光液顯色拍照。以β-actin為內(nèi)參，用BIO-RAD圖像分析軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SAS6.12軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 鈣離子對(duì)小鼠血清鐵和總鐵結(jié)合力的影響 相對(duì)于對(duì)照組，小鼠腹腔注射CaCl2溶液6、24 h后血清鐵明顯下降(P<0.05)；注射CaCl2溶液6、24 h后轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 鈣離子對(duì)血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的影響 ±s，n=6)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.2 鈣離子對(duì)小鼠肝臟hepcidin mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組(1.0±0.12)相比，腹腔注射CaCl2溶液6 h(0.45±0.09)、24 h(0.68±0.18)后，肝臟中hepcidin mRNA表達(dá)均下降，其中6 h下降顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 鈣離子對(duì)小鼠脾臟Fpn1蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組(1.0±0.18)相比，腹腔注射CaCl2溶液6 h(1.81±0.36)、24 h(1.35±0.41)后，脾臟中Fpn1蛋白表達(dá)均上升，其中6 h上升顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 信號(hào)分子在鈣離子對(duì)小鼠肝臟hepcidin mRNA表達(dá)中的變化 注射CaCl2溶液6 h后，p-SMAD蛋白在6 h略有下降，24 h后下降明顯，而p-STAT蛋白在6 h后下降明顯。見(jiàn)圖3。

圖1 鈣離子對(duì)小鼠肝臟hepcidin mRNA表達(dá)的影響

圖2 鈣離子對(duì)小鼠脾臟Fpn1蛋白表達(dá)的影響

圖3 鈣離子對(duì)小鼠肝臟p-SMAD、p-STAT蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

許多研究說(shuō)明，鐵代謝和鈣代謝之間有著復(fù)雜的關(guān)系。在地中海貧血和遺傳性血色病等鐵過(guò)載疾病中，除了有鐵過(guò)載外，還伴隨一系列骨病發(fā)生，包括軟骨病、脊柱側(cè)凸、脊柱畸形、骨折和嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松。絕經(jīng)后的婦女易發(fā)生骨質(zhì)疏松，往往也伴有鐵過(guò)載，鐵過(guò)載已成為骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素〔3,4〕。

hepcidin是主要由肝臟合成的小分子抗菌多肽，編碼hepcidin的基因稱(chēng)為HAMP。hepcidin作為鐵的調(diào)節(jié)激素，在鐵代謝中發(fā)揮著樞紐的作用〔5〕。本研究顯示，機(jī)體鈣離子增加可以引起血清鐵下降，使肝臟hepcidin表達(dá)減少，同時(shí)脾臟中Fpn1升高。Fpn1是唯一一個(gè)鐵輸出蛋白，hepcidin能夠和Fpn1相互結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Fpn1的內(nèi)化降解，從而減少鐵的釋放〔6〕；反之，肝臟中hepcidin表達(dá)增加，則脾臟中Fpn1含量減少。調(diào)節(jié)hepcidin的主要信號(hào)通路有：(1)BMP/SMAD途徑；(2)HFE/TfR2/Tf途徑，可以通過(guò)ERK信號(hào)分子調(diào)節(jié)hepcidin表達(dá)；(3)JAK/ STAT3途徑等〔7～9〕。檢測(cè)幾種關(guān)鍵信號(hào)分子結(jié)果顯示，BMP/SMAD和JAK/STAT3信號(hào)途徑可能共同協(xié)調(diào)參與了肝臟hepcidin mRNA的表達(dá)。

1 Rossi F,Perrotta S,Bellini G,etal.Iron overload causes osteoporosis in thalassemia major patients through interaction with transient receptor potential vanilloid type 1(TRPV1)channels〔J〕.Haematologica,2014;99(12):1876-84.

2 Shahbazkhani B,Aletaha N,Khonche A,etal.Is it necessary to screen for celiac disease in adult idiopathic osteoporosis〔J〕?Gastroenterol Hepatol Bed Bench,2015;8(2):140-5.

3 雷宇華,趙 娟,范婧琪,等.鐵對(duì)絕經(jīng)后婦女的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2013;33(2):453-4.

4 Toxqui L,Vaquero MP.Chronic iron deficiency as an emerging risk factor for osteoporosis:a hypothesis〔J〕.Nutrients,2015;7(4):2324-44.

5 Park CH,Valore EV,Waring AJ,etal.Hepcidin,a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver〔J〕.J Biol Chem,2001;276(11):7806-10.

6 Nemeth E,Tuttle MS,Powelson J,etal.Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization〔J〕.Science,2004;306(5704):2090-3.

7 Du X,She E,Gelbart T,etal.The serine protease TMPRSS6 is required to sense iron deficiency〔J〕.Science,2008;320(5879):1088-92.

8 Zhao N,Nizzi CP,Anderson SA,etal.Low intracellular iron increases the stability of matriptase-2〔J〕.J Biol Chem,2015;290(7):4432-46.

9 Wu Q,Wang H,An P,etal.HJV and HFE play distinct roles in regulating hepcidin〔J〕.Antioxid Redox Signal,2015;22(15):1325-36.

〔2016-03-19修回〕

(編輯 李相軍)

The effect and mechanism of calcium on hepcidin in mice liver

LEI Yu-Hua,Lü Yu-Hong,LIU Li,etal.

Department of Cell Biology,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,Hebei,China

Objective To study the effect and mechanism of calcium on the expression of mRNA hepcidin in the liver of mice.Methods The experimental mice were randomly divided into 3 groups,the control group was injected with 0.9% normal saline,the experimental group was injected with CaCl2 solution (140 mg/kg),0 h,6 h and 24 h respectively.Detection of serum iron and transferrin saturation,RT-PCR was performed for mRNA of hepcidin. Fpn1 protein and signaling molecules were determined by Western blot.Results Compared with those of control group,calcium ion reduced the serum iron and mRNA hepcidin expressions significantly (P<0.05),increased Fpn1,p-SMAD and p-STAT protein expressions.Conclusions Calcium ion could reduce hepcidin expression and affect iron metabolism. The SMAD and STAT pathway is involved in the regulation of hepcidin.

Calcium ion;Hepcidin;Fpn1;Iron metabolism

國(guó)家自然科學(xué)基金(31340064)；河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究青年基金(2011177)；河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2017101001196)

常彥忠(1965-)，男，博士，教授，主要從事鐵代謝研究。

雷宇華(1972-)，女，博士，副教授，主要從事鐵代謝研究。

Q581

A

1005-9202(2017)04-0784-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.002

1 河北師范大學(xué)生命科學(xué)院鐵代謝分子生物學(xué)研究室