siRNA靶向沉默YAP1對卵巢癌細胞skov3增殖凋亡的影響

毛靜月 劉 蕊 李彩云 孟 瑩

(中國人民解放軍第一一七醫院婦產科,浙江 杭州 310013)

siRNA靶向沉默YAP1對卵巢癌細胞skov3增殖凋亡的影響

毛靜月 劉 蕊1李彩云 孟 瑩2

(中國人民解放軍第一一七醫院婦產科,浙江 杭州 310013)

目的 探討小干擾RNA(siRNA)靶向沉默Yes相關蛋白(YAP)1基因表達對人卵巢癌細胞skov3增殖凋亡的影響。方法 采用脂質體LipofectamineTM2000將靶向干擾YAP1 的siRNA轉染至對數生長期skov3細胞(siYAP1組)，同時設不行轉染處理的對照組和轉染隨機序列siRNA的轉染對照組(siControl組)，轉染48 h后采用實時定量PCR(qPCR)檢測各組的YAP1 mRNA水平；采用水溶性四氮唑(WST-1)法評價各組轉染后的增殖情況，分別采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細胞術及qPCR檢測轉染后凋亡率及凋亡相關蛋白(抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和促凋亡蛋白Bid、Bax)的mRNA水平，PI單染流式細胞術檢測轉染后的細胞周期分布情況。結果 qPCR法檢測發現siYAP1組轉染48 h后的YAP1 mRNA水平為(0.141±0.018)，低于對照組和siControl組(均P<0.05)，提示在skov3細胞中靶向沉默YAP1成功；skov3細胞經siRNA靶向沉默YAP1表達后的生長增殖受明顯抑制、凋亡形態明顯改變及發生G0/G1期細胞周期阻滯，與對照組和siControl組相比，siYAP1組的增殖抑制率、凋亡率、促凋亡蛋白水平及G0/G1期細胞比例均升高，而促凋亡蛋白水平及S期細胞比例均降低(P<0.05)；對照組和siControl組增殖、凋亡及細胞周期相關指標的差異無統計學意義(P>0.05)。結論 通過siRNA在基因水平上沉默YAP1表達可抑制skov3細胞的增殖并誘發凋亡和細胞周期阻滯，在卵巢癌的靶向治療中可能有一定前景。

Yes相關蛋白1；卵巢癌；增殖；凋亡

卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，由于目前缺乏早期篩查手段及發病較隱匿，發現時多為晚期，病死率較高，常規治療手段效果不理想〔1,2〕。近年來發現Hippo-YAP通路作為一種新抑癌信號通路，在調控腫瘤發生發展中發揮重要作用〔3〕。Yes相關蛋白(YAP)1是Hippo-YAP通路的下游重要效應分子，可調控細胞增殖和凋亡過程，可能在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，并有望成為靶向治療的一個新靶點〔4,5〕。因此，本研究采用小干擾RNA(siRNA)技術靶向沉默人卵巢癌細胞skov3的YAP1表達，探討在基因水平沉默YAP1基因對skov3細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人卵巢癌細胞skov3購于上海吉凱基因技術有限公司，總RNA抽提Trizol購于碧云天生物試劑有限公司，脂質體LipofectamineTM2000 購于美國Invitrogen公司，胎牛血清(FBS)、RPMI1640細胞培養液購于Gibco BRL公司，水溶性四氮唑(WST-1)購于上海寶曼生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于Becton Dickinson公司，M-MLV逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)購自Roche公司，靶向干擾YAP1的siRNA(sc-38637)及對照siRNA(YAP1-NC，sc-37007)購自美國Santa Cruz 生物公司。

1.2 細胞轉染及分組 采用含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養液培養skov3細胞，常規條件培養，待細胞融合度達80%以上時分為3組：(1)對照組，不行轉染處理；(2)轉染對照組(siControl組)，轉染隨機序列siRNA；(3)siYAP1組，轉染靶向干擾YAP1 的siRNA；采用脂質體LipofectamineTM2000進行siRNA轉染，當每孔細胞數約為1.5×105個，siRNA濃度約為40 nmol/L，且LipofectamineTM2000與siRNA比例為1∶1(6孔)時，有較佳的轉染效率。

1.3 細胞增殖活性檢測 取處于增殖期的對照組、siControl組和siYAP1組的skov3細胞，調整細胞濃度為1.5×104個/ml并制備成細胞懸液，以每孔180 μl接種96孔，常規培養24、48、72、96 h后加入20 μl WST-1試劑，混勻后繼續孵育4 h，采用全自動酶標儀檢測450 nm波長下的吸光值(A450)并計算增殖抑制率：抑制率(%)=(對照組A450-siControl組A450或siYAP1組A450)/對照組A450×100%。

1.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細胞術檢測凋亡率 取處于增殖期的對照組、siControl組和siYAP1組的skov3細胞，調整細胞濃度為2×106個/ml，以每孔2 ml接種于6孔培養板，常規條件下培養48、96 h后收集細胞依次加入5 μl Annexin Ⅴ FITC和5 μl PI后，根據凋亡檢測試劑盒避光于冰上孵育10 min后，將細胞重懸后將樣品逐一上機檢測，每組設3個復孔，計算凋亡率。

1.5 實時定量PCR(qPCR)檢測YAP1及凋亡相關蛋白的mRNA水平 收集對照組、siControl組和siYAP1組轉染48 h后的skov3細胞，采用Trizol試劑提取總RNA，采用M-MLV逆轉錄試劑盒將符合純度和濃度要求的RNA逆轉錄成cDNA，在羅氏熒光定量PCR Light Cycler 480平臺上，采用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)檢測細胞中YAP1及凋亡相關蛋白(抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和促凋亡蛋白Bid、Bax)的mRNA水平，以GAPDH為內參。CCAT2上游引物：5'-CTTCGGCTTTATGGCTACCT-3'，下游引物：5'-AAGGTCAGATGGTGGTTGTTC-3';GAPDH上游引物：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，下游引物:5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3。采用2-△△Ct法計算細胞中YAP1、Bcl-2、Mcl-1、Bid和Bax 的相對表達量。每個樣本設立三個平行管。

1.6 流式細胞術檢測 收集對照組、siControl組和siYAP1組轉染48 h后的skov3細胞，采用胰蛋白酶消化后，經PBS重懸后用乙醇固定30 min，加入100 μg/ml RNase和50 μg/ml PI共1 ml，避光染色30 min，采用美國Beckman公司的Epics-XLⅡ型流式細胞儀分析細胞周期變化，采用軟件分別計算不同周期(G0/G1、S、G2/M)細胞數目占細胞總數的百分比。

1.7 統計學分析 采用SPSS16.0軟件，多個樣本均數間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonfferoni檢驗。

2 結 果

2.1 siRNA靶向沉默skov3細胞中YAP1的效果分析 以對照組為參考(1.000)，siControl組和SiYAP1組的YAP1 mRNA水平分別為(0.974±0.051)和(0.141±0.018)，SiYAP1組的YAP1 mRNA水平低于對照組和siControl組(均P<0.05)；對照組和siControl組YAP1 mRNA的差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細胞增殖的影響 skov3細胞經siRNA靶向沉默YAP1表達后的生長增殖受到明顯抑制，在24～96 h的觀察時間內siYAP1組的增殖抑制率均高于對照組和siControl組，如與siControl組96 h的增殖抑制率相比，siYAP1組的增殖抑制率升高(72.16±5.21)倍(P<0.05)；對照組和siControl組增殖抑制率的差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細胞增殖的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與siControl組比較：2)P<0.05；下表同

2.3 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細胞凋亡率的影響 skov3細胞經siRNA靶向沉默YAP1表達后凋亡形態明顯改變，siYAP1組轉染后48、96 h的凋亡率均高于對照組和siControl組(均P<0.05)；對照組和siControl組增殖抑制率差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細胞凋亡相關基因的影響 skov3細胞經siRNA靶向沉默YAP1表達后促凋亡基因表達升高，而抗凋亡基因表達降低，如siYAP1組轉染后48 h的Bcl-2、Mcl-1 mRNA水平均降低，Bid、Bax mRNA水平均升高(均P<0.05)；對照組和siControl組Bcl-2、Mcl-1、Bid和Bax mRNA水平差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 siRNA靶向沉默YAP1對skov3 細胞凋亡率的影響±s,%)

表3 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細胞凋亡相關基因的影響

2.5 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細胞周期的影響 skov3細胞經siRNA靶向沉默YAP1表達后發生明顯的G0/G1期細胞周期阻滯，如siYAP1組轉染后48 h的G0/G1期細胞比例升高，S期細胞比例降低(均P<0.05)，但G2/M期細胞比例未發生明顯變化；對照組和siControl組細胞周期分布的差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 siRNA靶向沉默YAP1對skov3 細胞周期的影響

3 討 論

Hippo-YAP信號通路中包含多個蛋白激酶和轉錄活性因子，可調節細胞增殖和凋亡兩者間的平衡，繼而調控組織再生，由于其在腫瘤發生發展中發揮重要作用，成為目前的研究熱點〔6〕。YAP1作為Hippo-YAP信號通路的下游效應分子，受該通路的負性調控，主要以磷酸化的形式發揮作用〔7〕。Hippo-YAP通路為抑癌通路，在惡性腫瘤中常處于失活狀態，而YAP1可與其下游的轉錄因子相互作用，如細胞周期蛋白E和凋亡調控因子等，繼而促進增殖和抑制凋亡，導致惡性腫瘤的發生發展〔8〕。多項研究發現抑制YAP1表達可達到抑制腫瘤細胞增殖并誘導凋亡的效果。朱世凱等〔9〕的研究發現在胰腺細胞PANC-1中采用特異性siRNA靶向沉默YAP1可抑制胰腺癌細胞的增殖并促進凋亡，同時對該細胞株的體外侵襲能力有顯著的抑制效果。黃惠等〔10〕研究證實在宮頸癌Hela細胞中沉默YAP1可顯著抑制抑制該細胞的增殖及侵襲能力。Zhao等〔11〕的研究發現在食管癌細胞EC109 中采用shRNA沉默YAP1可顯著抑制其細胞增殖和生長。以上研究均提示靶向沉默YAP1可為腫瘤的防治提供新思路，但目前YAP1在卵巢癌中的作用尚不清楚。

本研究采用經典的脂質體法進行靶向YAP1的siRNA轉染，qPCR結果顯示轉染48 h后的YAP1 mRNA水平降低，且轉染對照序列未發生明顯變化，表明在skov3細胞中靶向沉默YAP1成功。腫瘤的發生是一個復雜的過程，伴隨著一系列的變化，包括細胞形態、增殖、細胞周期、凋亡和侵襲等。本研究結果顯示靶向沉默YAP1可抑制細胞增殖并促進細胞凋亡和誘導細胞周期阻滯。類似的結果已被廣泛報道，如Diep等〔12〕發現YAP1蛋白表達下調可抑制胰腺癌細胞的增殖，同時細胞的克隆形成能力減弱；Muramatsu等〔13〕報道YAP1敲除后可抑制食管鱗狀細胞癌細胞增殖，且細胞主要停留在G0/G1期，并誘導P21增加和減少Survivin的轉錄。本研究的不足為沒有在體內水平研究靶向沉默YAP1對卵巢癌增殖凋亡的影響，下一步將在動物實驗中驗證本發現。

1 李燦宇,張自森,薛長年,等.熱灌注順鉑治療晚期卵巢癌惡性腹腔積液的臨床療效〔J〕.中國老年學雜志,2012;32(17):3656-8.

2 Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2015 〔J〕.CA Cancer J Clin,2015;65(1):5-29.

3 羅 華.YAP蛋白在老年胃癌中的表達及其對預后的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(24):6140-1.

4 Cottini F,Anderson KC,Tonon G.Awakening the Hippo co-activator YAP1,a mercurial cancer gene,in hematologic cancers 〔J〕.Mol Cell Oncol,2014;1(3):e970055.

5 Cottini F,Hideshima T,Xu C,etal.Rescue of Hippo coactivator YAP1 triggers DNA damage-induced apoptosis in hematological cancers 〔J〕.Nat Med,2014;20(6):599-606.

6 Zhou GX,Li XY,Zhang Q,etal.Effects of the hippo signaling pathway in human gastric cancer 〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2013;14(9):5199-205.

7 Xu ZP,Zhu JS,Zhang Q,etal.A breakdown of the Hippo pathway in gastric cancer 〔J〕.Hepatogastroenterology,2011;58(110-111):1611-7.

8 Zhao Y,Zhou W,Xue L,etal.Nicotine activates YAP1 through nAChRs mediated signaling in esophageal squamous cell cancer(ESCC)〔J〕.PLoS One,2014;9(3):e90836.

9 朱世凱,周 玉,汪旭東,等.特異性siRNA沉默YAPl基因表達對胰腺癌細胞惡性生物學行為的影響〔J〕.中華普通外科雜志,2014;29(9):719-22.

10 黃 惠，吳 磊，胡 艷，等.siRNA 沉默YAP1 對宮頸癌Hela 細胞增殖和侵襲的影響〔J〕.現代腫瘤醫學,2016;24(2):177-80.

11 Zhao J,Li X,Yang Y,etal.Effect of YAP1 silencing on esophageal cancer〔J〕.Oncotargets Ther,2016;9(Issuel):3137-46.

12 Diep CH,Zucker KM,Hostetter G,etal.Down-regulation of Yes associated protein 1 expression reduces cell proliferation and clonogenicity of pancreatic cancer cells 〔J〕.PLoS One,2012;7(3):e32783.

13 Muramatsu T,Imoto I,Matsui T,etal.YAP is a candidate oncogene for esophageal squamous-cell carcinoma 〔J〕.Carcinogenesis,2010;32(3):389-98.

〔2016-05-19修回〕

(編輯 徐 杰)

國家自然科學基金青年基金(30900659);廣東省醫學科學技術研究基金(B2009151)

孟 瑩(1974-)，女，博士，主任醫師，主要從事肺間質纖維化、COPD、肺癌等研究。

毛靜月(1975-)，女，碩士，主治醫師，主要從事婦產科研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0797-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.007

1 火箭軍總醫院婦產科 2 廣州南方醫院呼吸科