姜黃素調控食管癌Eca-109細胞分化、增殖、凋亡的機制

金宇斌 李立德 韓 瑩 苗春興 張 霞 李勝龍

(牡丹江醫學院第二附屬醫院胸外科，黑龍江 牡丹江 157009)

姜黃素調控食管癌Eca-109細胞分化、增殖、凋亡的機制

金宇斌 李立德1韓 瑩 苗春興 張 霞 李勝龍

(牡丹江醫學院第二附屬醫院胸外科，黑龍江 牡丹江 157009)

目的 探討姜黃素對食管癌Eca-109細胞的分化、增殖、凋亡及分泌信號蛋白(Wnt)信號通路的影響及機制。方法 MTT法檢測8、16、32、64 μmol/L的姜黃素作用于食管癌Eca-109細胞24、48、72 h后細胞存活情況，計算細胞凋亡率，原位末端標記法(TUNEL)檢測48 h后細胞凋亡情況，RT-PCR檢測48 h后細胞中β連環蛋白(β-catenin)、GSK-3β、c-myc的mRNA的表達情況，Western印跡檢測48 h后細胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc蛋白的表達情況。 結果 姜黃素對食管癌Eca-109細胞的抑制作用隨著作用時間和作用濃度的增加而增加，姜黃素作用24 h IC50為28.1 μmol/L，48 h為23.2 μmol/L，72 h為15.6 μmol/L。TUNEL檢測細胞凋亡率隨著藥物作用濃度的增加而增加。β-catenin、c-myc的轉錄水平隨著藥物濃度的增加而減弱。GSK-3β的轉錄水平隨著藥物濃度的增加而加強。β-catenin、c-myc蛋白表達量隨著藥物濃度的增加而減弱。GSK-3β蛋白表達水平隨著藥物濃度的增加而加強。結論 姜黃素可以抑制食管癌Eca-109細胞增殖，促進細胞凋亡。姜黃素可以上調Wnt信號通路中GSK-3β酶的表達、促進β-catenin蛋白降解，從而抑制c-myc基因的轉錄，抑制癌細胞生長增殖。

食管癌；增殖；凋亡；信號通路

食管癌早期發病癥狀不明顯，確診后一般已經發展到食管癌晚期〔1〕。常見的治療方法有手術治療、化療和放射治療。但手術治療方法有限，化療效果顯著但副作用大，長期化療會引起一系列的繼發感染，損害人體其他正常細胞的正常功能。姜黃素是從姜科植物郁金塊根、姜黃根莖等提取的一種植物多酚，具有利膽、抗金黃色葡萄球菌等藥理作用〔2〕。對癌癥、老年癡呆等具有治療作用。姜黃素對胃癌、肝癌、乳腺癌、淋巴癌等具有很好的抑制作用〔3〕，目前姜黃素對食管癌的作用機制尚不清楚。分泌信號蛋白(Wnt)信號通路在細胞的生長增殖過程中起決定性作用，其中β連環蛋白(β-catenin)、GSK-3β、c-myc是該信號通路中關鍵因子〔4〕。本研究擬探討姜黃素對食管癌細胞增殖凋亡的影響及與Wnt信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：食管癌細胞Eca-109購自中科院上海細胞所。主要儀器和設備：酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)，紫外分光光度計(美國Thermo)，CO2培養箱(日本SANYO)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，倒置顯微鏡(日本尼康)，PCR儀(美國Beckman Coulter)，離心機(湖南恒諾醫用設備有限公司)，反轉錄試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，RPMI-1640培養基(美國Sigma)，PCR擴增試劑盒(美國Thermo)，瓊脂糖(美國Thermo)，抗體稀釋液(杭州聯科生物股份有限公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青有限公司)，TUNEL細胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，青鏈霉素(美國Sigma)，姜黃素粉(杭州默沙東生物制藥有限公司)，胰蛋白酶(美國Sigma)，RNA提取試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，細胞總蛋白提取(碧云天生物技術有限公司)，PBS(上海欣百諾生物工程有限公司)，β-actin單克隆抗體(美國Bioworld)，β-catenin單克隆抗體(美國Bioworld)，GSK-3β單克隆抗體(美國Bioworld)，c-myc單克隆抗體(美國Bioworld)，辣根過氧化物標記的二抗(美國Bioworld)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將液氮罐中保存的食管癌細胞Eca-109取出，放置于37℃的水浴鍋中融化，觀察細胞融化后，移液槍吹打細胞混勻后，轉移至15 ml離心管中，加入10 ml細胞培養液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基)懸浮細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入3 ml細胞培養液重懸細胞，轉移至細胞培養瓶中，37℃，5%CO2培養箱中培養。觀察細胞長滿細胞瓶時，倒掉細胞培養液，加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞。倒置顯微鏡下觀察細胞間隙變大時，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS洗滌細胞，加入適量細胞培養液接種于新的細胞瓶中，37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 噻唑藍(MTT)法觀察細胞增殖情況 培養至對數生長期的食管癌細胞Eca-109，胰蛋白酶消化后，PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入細胞生長液調整細胞濃度為5×104個/ml，接種于96孔細胞培養板中，每孔加入細胞懸浮液100 μl，37℃，5%CO2培養基中培養24 h。吸除培養液，加入不同濃度的姜黃素使終濃度為8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L，同時設置空白組和陰性對照組，空白組中不加細胞加入等量的姜黃素，陰性對照組中加入等量的細胞生長液代替藥物。為了提高實驗結果的精確性，減小實驗誤差，每組設置10個復孔。放置于37℃，CO2培養箱中培養24、48、72 h。培養結束后加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，37℃孵育4 h。棄去上清，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100 μl，37℃孵育震蕩10 min。用酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光度(OD值)，每組實驗數據取各孔的平均值，計算細胞的IC50和細胞抑制率，細胞抑制率=1-(藥物作用組-空白組)/(對照細胞組-空白組)。

1.2.3 原位末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡 終濃度為8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L的姜黃素與Eca-109細胞作用48 h后。加入4%多聚甲醛固定液放置于室溫下固定細胞30 min，棄上清，PBS洗滌細胞3次，3 min/次，加入3%H2O2甲醇阻斷內源性氧化物酶，孵育30 min，加入PBS洗片。加入含有0.1%TritonX-100的0.1%的枸櫞酸鈉溶液作為通透液，放置于冰盒中孵育2 min，小心吸除液體，加入轉化劑過氧化物酶(POD)50 μl，蓋上蓋玻片，37℃于濕盒中反應30 min，洗片。加入100 μl二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑顯色，室溫靜置15 min，用酒精脫水后，用二甲苯透明封片。同時設置對照組。顯微鏡下觀察細胞核為棕紅色為陽性，計算凋亡率。凋亡率的計算方法：胞核為紅棕色的細胞數與總細胞數量的百分比。

1.2.4 RT-PCR檢測細胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc的表達 食管癌細胞Eca-109經8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L的姜黃素作用48 h后，PBS洗滌細胞，加入適量的Trizol Reagent裂解食管癌細胞，用氯仿抽提，吸取水相層到新EP管中，加入異丙醇混勻，12 000 r/min離心15 min。用提前預冷的乙醇洗滌，放置于室溫下風干，用RNAse free溶解RNA，保存于-80℃備用。用紫外分光光度計檢測RNA純度及濃度，OD260 nm/OD280 nm比值1.8～2.0認為RNA純度很高。反轉錄系統合成β-catenin、GSK-3β、c-myc的cDNA。PCR擴增β-catenin、GSK-3β、c-myc的cDNA。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，凝膠系統成像。運用Image J分析目的基因表達率。

1.2.5 Western印跡檢測藥物作用后Eca-109細胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc表達 取對數生長期的食管癌細胞Eca-109經胰蛋白酶消化后，接種于6孔細胞培養板中，觀察細胞貼壁后，棄細胞培養液，加入姜黃素終濃度為8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L的培養基，37℃，CO2培養箱中培養48 h。PBS洗滌2次，加入胰蛋白酶消化細胞，將細胞懸液轉移到新的EP管中，PBS重懸細胞。按照細胞總蛋白提取試劑盒步驟提取細胞蛋白。按照蛋白濃度測定試劑盒操作步驟測定提取的蛋白濃度。在蛋白樣品中加上樣緩沖液混合后，煮沸變性5 min。每孔中加50 μl樣品，電壓80 V，marker進入分離膠后，將電壓升高至120 V，電泳結束后將蛋白凝膠取出，濾紙、凝膠、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、濾紙依次夾好，4℃轉膜過夜。取膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗4℃過夜，TBST洗膜，加入二抗室溫下孵育1.5 h。TBST洗膜后，顯影，通過Odyssey掃描系統分析蛋白表達量。

2 結 果

2.1 MTT法檢測細胞抑制情況 作用時間為24、48、72 h的8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L濃度的姜黃素作用食管癌細胞Eca-109后的抑制率與對照組相比均差異顯著(P<0.05)。姜黃素對食管癌Eca-109細胞的抑制作用隨著作用時間和作用濃度的增加而增加。計算姜黃素作用24 h IC50為28.1 μmol/L、48 h IC50為23.2 μmol/L、72 h IC50為15.6 μmol/L。見表1。

表1 MTT法檢測姜黃素作用后食管癌Eca-109細胞的 抑制率

與對照組比較:1)P<0.05

2.2 TUNEL檢測姜黃素作用后的食管癌細胞凋亡情況 姜黃素濃度為8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L與細胞Eca-109作用48 h后，TUNEL檢測細胞凋亡率分別為0.325 4±0.011 5，0.451 9±0.021 4，0.681 6±0.017 8，0.853 4±0.021 7。對照組的細胞凋亡率為0.056 5±0.002 7。各濃度姜黃素作用后的細胞Eca-109凋亡率與對照組相比均差異顯著(P<0.05)。姜黃素可以促進食管癌Eca-109細胞凋亡。

2.3 RT-PCR檢測藥物作用后細胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc的mRNA的表達 8、16、32、64 μmol/L姜黃素作用后β-catenin、GSK-3β、GSK-3β、c-myc的表達率與對照組相比差異顯著(P<0.05)。姜黃素可以抑制食管癌細胞Eca-109中β-catenin、c-myc的轉錄，隨著作用濃度的增加，抑制作用加強。姜黃素可以促進食管癌細胞Eca-109中GSK-3β的轉錄，隨著作用濃度的增加，促進作用加強。見表2。

2.4 Western印跡檢測β-catenin、GSK-3β、c-myc的表達 各濃度姜黃素作用后的Eca-109細胞中β-catenin蛋白表達率、GSK-3β蛋白表達率、c-myc蛋白表達率與對照組相比差異顯著(P<0.05)。姜黃素可以抑制β-catenin、c-myc蛋白的表達，且隨著作用濃度的增加抑制作用增強。姜黃素可以促進GSK-3β蛋白的表達，且隨著作用濃度的增加促進作用增強。見表3，圖1。

表2 RT-PCR檢測姜黃素作用后細胞中β-catenin、 GSK-3β、c-myc 表達率

與0 μmol/L比較：1)P<0.05；與0 μmol/L比較：2)P<0.01，下表同

表3 Western印跡檢測藥物作用后細胞中β-catenin、 GSK-3β、c-myc蛋白表達率

圖1 Western印跡檢測藥物作用后細胞中β-catenin、 GSK-3β、c-myc蛋白表達

3 討 論

姜黃素是一種用從姜科植物中提取的植物色素。姜黃素的藥用歷史悠久，具有多種藥用價值，在治療胸脅刺痛、風濕引起的肩膀疼痛、閉經、跌打腫痛等方面療效顯著。另外姜黃素還可以調節血脂、消炎、抗纖維化、抗動脈硬化、預防癌癥、治療癌癥。姜黃素有多種用途，在臨床上也具有極高的應用價值〔5〕。由于姜黃素提取至植物中，副作用小，姜黃素的抗腫瘤功效越來越成為研究熱點。研究表明，姜黃素具有抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡等作用〔6〕。

細胞凋亡是一種正常情況下的細胞程序性死亡，受多基因調控〔7〕。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡是一種嚴格程序下細胞自我毀滅的死亡。細胞凋亡涉及一系列復雜的過程，受多種機制調控，與多種信號通路有關，受多種凋亡因子作用。正常情況下，細胞的增殖與凋亡處于動態平衡狀態〔8〕。腫瘤的發生是腫瘤細胞增殖與凋亡平衡被打破造成的。研究表明，姜黃素可以通過作用于細胞線粒體，改變細胞線粒體膜通透性，細胞色素C趁機被釋放而引起細胞凋亡〔9〕。另外，姜黃素可以促進凋亡基因Bax的表達，抑制Bcl-2轉錄而促進細胞凋亡。本研究顯示藥物作用后的食管癌Eca-109細胞增殖作用明顯減弱，藥物濃度越大，姜黃素抑制作用越明顯，藥物作用時間越長，姜黃素抑制作用也越明顯。TUNEL結果顯示，姜黃素可以促進食管癌Eca-109細胞凋亡。

Wnt信號通路與細胞的增殖分化有密切關系。Wnt信號通路是由跨膜蛋白(Fz)、Wnt、大腸腺瘤息蛋白(APC)、β-catenin等組成，這些蛋白分子將信號從細胞表面傳遞至細胞內。β-catenin的多少決定了Wnt信號通路開啟還是關閉〔10〕。當細胞內β-catenin蛋白表達水平升高，Wnt信號通路開啟，β-catenin蛋白表達水平降低，Wnt信號通路關閉。β-catenin蛋白的表達受相關因子的調控，GSK-3β、APC可以阻礙β-catenin蛋白作用，而散亂蛋白(Dishevelled)可以促進β-catenin蛋白的作用。正常情況下，細胞漿內的一部分β-catenin蛋白結合在細胞膜上，另一部分蛋白被GSB-3β、APC、Axin復合物降解。當Wnt蛋白與Frzzelds、LRP-5、LRP-6形成的跨膜受體結合，降解GSB-3β、APC、Axin形成的復合物，使β-catenin蛋白降解受阻。聚集在細胞質中的β-catenin蛋白受到相關轉錄因子作用進入細胞核，促進癌基因的惡性增殖。其中GSB-3β是細胞質中β-catenin升高的關鍵酶，可以負調控β-catenin蛋白〔11〕。c-myc是信號通路Wnt的一個靶基因，在細胞持續增殖過程中起重要作用，屬于細胞核內的癌基因。當信號通路Wnt激活后，靶基因c-myc被激活，大量表達，細胞惡性增殖〔12〕。

本研究提示姜黃素可以抑制食管癌Eca-109細胞的增殖分化，通過干擾細胞周期，促進細胞凋亡。姜黃素能促進GSB-3β的表達而促進β-catenin降解，減少細胞中β-catenin的含量從而阻礙c-myc癌基因表達，干擾癌細胞的Wnt信號通路，抑制癌細胞增殖。

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〔2016-06-21修回〕

(編輯 袁左鳴)

李立德(1981-)，男，主治醫師，主要從事食道癌研究。

金宇斌(1973-)，男，副主任醫師，主要從事食道癌研究。

R735

A

1005-9202(2017)04-0806-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.010

1 牡丹江醫學院第二附屬醫院教研科