Nr4a1拮抗劑抑制肺癌細胞的上皮-間質轉化的作用機制

毛小亮 童繼春 朱 征 殷亞俊 王燁銘 石亮榮

(常州市第二人民醫院胸心外科,江蘇 常州 213000)

Nr4a1拮抗劑抑制肺癌細胞的上皮-間質轉化的作用機制

毛小亮 童繼春 朱 征 殷亞俊 王燁銘 石亮榮1

(常州市第二人民醫院胸心外科,江蘇 常州 213000)

目的 觀察Nr4a1拮抗劑在αVβ6-ERK-ETS1通路中抑制肺癌細胞上皮-間質轉化的作用。方法 培養傳代肺癌A549細胞系，分為實驗組及對照組，兩組均采用生長因子誘導上皮-間質轉化過程，實驗組采用Nr4a1拮抗劑阻斷αVβ6-ERK-ETS1通路，對照組不采用拮抗劑，采用流式細胞術及Western印跡檢測信號通路中相關蛋白表達水平。結果 形態學上，實驗組組細胞呈梭形或類似于成纖維細胞的形態，而對照組部分細胞呈圓形或卵圓形。Western印跡及流式細胞檢測均發現對照組細胞上皮細胞標志物E-cadherin、γ-catenin及αvβ6 表達均較處理前顯著降低，而間質細胞標記物Nβ-cateinin、Vimentin表達則有不同程度升高(P<0.05)。結論 Nr4a1拮抗劑能夠通過αVβ6-ERK-ETS1通路抑制肺癌細胞的上皮-間質轉化。

Nr4al拮抗劑；αVβ6-ERK-ETS1通路；上皮-間質轉化

上皮-間質轉換(EMT)是腫瘤轉移主要的機制之一，上皮細胞轉換為間質細胞過程中，表面的相關標識蛋白如E-cadherin、Occludin、Z01和Cytokeratin表達逐漸下調，而N-cadherin、Vimentin和Fibronectin等間質細胞標識蛋白表達上調〔1〕。

αVβ6-ERK-ETS1通路是細胞內外信號傳導重要通路，參與腫瘤細胞的轉移過程，但具體機制尚不明確。Nr4a1是早期反應基因家族中的一員，可以接受細胞外信號，對不同靶基因的轉錄進行調控。目前，大量體內體外研究證實Nr4a1與各種實體腫瘤的轉移也存在密切的關系〔2～4〕。因此，Nr4a1是否通過αVβ6-erk-ets1通路誘發肺癌細胞發生轉移尚缺乏研究。本實驗通過檢測肺癌A549細胞中相關蛋白的表達水平，探討Nr4a1促進轉移的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌A549細胞系，RPMI 1640培養液，αVβ6單克隆抗體，Nr4a1拮抗劑，抗ERK 單抗、E-cadherin抗體、Vimentin抗體、p-ERK抗體、α-catenin抗體、Fat-1抗體、γ-catenin抗體、Nβ-cateinin抗體、P38抗體、JNK抗體、PI3K抗體、AKT抗體等,轉錄因子活性檢測試劑盒、流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 肺癌A549細胞系的傳代及培養 取出存有肺癌A549細胞的凍存管，放于37℃溫水中，用鑷子夾住輕輕搖動使其迅速融化。1 000～2 000 r/min離心3～5 min，無菌條件下打開凍存管，移去上清液，加入1 ml預熱的細胞培養液將細胞吹散開，然后轉移至25 cm2培養瓶中。加入4 ml的RPMI 1640培養液及10%的胎牛血清。置于37℃、5%CO2培養24 h后，更換培養液。后加入1 ml消化液，在37℃培養箱中孵育5～8 min后把培養瓶放置在倒置顯微鏡下觀察，發現細胞的胞質回縮、胞間質增大后終止消化。加入5 ml預熱至37℃的培養液，反復吹打后，吸取一半的細胞懸液，以1∶2傳代接種到新的25 cm2培養瓶中，補足培養液至5～10 ml，加10%～20%的胎牛血清。倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養，分別加入制備細胞懸液待用。實驗組采用Nr4a1多克隆抗體及生長因子(終濃度是10 ng/ml TGF-β1,25 ng/ml EGF)分別加入培養基中，對照組只加入生長因子。

1.2.2 制備細胞蛋白 將細胞懸液加入15 ml離心管中，2 500 r/min離心5 min。棄上清，加入4 ml PBS并輕輕吹打洗滌，再次2 500 r/min離心5 min。棄上清后用PBS重復洗滌一次。用槍洗干上清后，加100 μl裂解液(含PMSF)冰上裂解30 min。4℃、12 000 r/min離心5 min，取上清分裝于1.5 ml離心管中并置于-20℃備用。

1.2.3 流式細胞術檢測 取生長較好的實驗組及對照組細胞，胰酶消化，1 ml PBS清洗后移入15 ml BD管中。800 r/min離心5 min，去上清，PBS吹洗，再次離心棄上清，重復2次，用0.1 ml冰PBS重懸，移到1.5 ml EP管中。分別按照1∶100加入1 U上皮標志標志物E-cadherin、γ-catenin抗體和間質標志物Nβ-cateinin、Vimentin單克隆抗體，室溫孵育1 h，1 000 r/min離心5 min，去上清，PBS吹洗細胞，再次離心棄上清，重復3次，最后重懸于0.5 ml PBS中。按照1∶100分別加入熒光二抗，移入流式管，錫紙包裹避光，上流式細胞儀測定實驗組和對照組肺癌細胞表面上皮標志物和間質標志物的表達情況。

1.2.4 Western印跡檢測 分別收集實驗組及對照組細胞制備的備用蛋白，制作標準曲線，加入5倍SDS 上樣緩沖液至終濃度為1倍。沸水中煮5 min使蛋白變性。上樣，電泳4 h，電壓為40 V，轉膜，脫色后晾干備用。上搖床5%脫脂牛奶封閉1 h，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，室溫下孵育1～2 h后，用TBST脫色洗2次，每次10 min；再用TBS洗1次，10 min。重復上述步驟加入二抗，ECL法化學發光，顯影，定影。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0軟件，兩個樣本間的比較采用t檢驗，多個樣本及組間比較采用方差分析。

2 結 果

2.1 Nr4a1拮抗劑處理前后肺癌細胞形態學變化 實驗組細胞呈梭形或類似于成纖維細胞的形態，而對照組部分細胞呈圓形或卵圓形(圖1)。生長因子可以誘導上皮細胞向間質細胞轉化。

2.2 Western印跡檢測調控EMT過程信號通路中相關蛋白及其磷酸化水平 如圖2，對照組(7.2 mmol/L,1.2 mmol/L)較實驗組ERK(12.5 mmol/L)及p-ERK(1.6 mmol/L)表達水平顯著降低(P<0.05)，而AKT(實驗組1.8 mmol/L，對照組1.2 mmol/L)、PI3K(實驗組13.2 mmol/L，對照組14.8 mmol/L)及MAPK信號通路中其他分子JNK(實驗組8.9 mmol/L，對照組9.0 mmol/L)、p-JNK(實驗組3.8 mmol/L，對照組4.0 mmol/L)、p-P38(實驗組4.3 mmol/L，對照組4.5 mmol/L)、p-AKT(實驗組6.8 mmol/L，對照組6.5 mmol/L)P38、JNK等無顯著差異(P>0.05)。內參GAPDH水平為10 mmol/L。

圖1 實驗組與對照組細胞形態學變化

圖2 兩組中調控EMT過程信號通路中 相關蛋白及其磷酸化水平

2.3 流式細胞術檢測細胞EMT過程重要分子表達差異性 流式細胞儀檢測發現，對照組細胞E-cadherin、γ-catenin及αvβ6 均較處理前表達顯著降低，而間質細胞標記物Nβ-cateinin、Vimentin表達不同程度升高(P<0.05)。

3 討 論

目前，EMT與腫瘤侵襲轉移的關系已經得到明確，也為腫瘤的治療提供了新的靶點〔5,6〕。實體腫瘤癌細胞來源于上皮細胞，具有極性，通過各種連接方式緊密黏附在一起，無法自由移動；而間質細胞無極性，可以自由移動。因此，癌細胞侵襲轉移時，可以通過重新啟動上皮-間質轉換“程序”轉換為間質細胞，獲得具有自由遷移運動能力，釋放相關酶，在細胞間穿行，穿越基底膜，進入脈管系統，侵襲到遠處組織〔7〕。

整合素是一種連接細胞和細胞外環境的跨膜受體，可以通過跨膜作用將外界刺激相關信息傳入細胞。 因此，整合素參與了細胞周期調節、細胞形態變化以及運動等生理作用。而αvβ6是唯一僅存于惡性上皮源性腫瘤表面的整合素，可以作為一種抗惡性上皮性腫瘤的靶目標〔8〕。Ets1是Ets轉錄因子家族中一類轉錄因子，能夠結合基因上游特異蛋白質，活化后從胞質轉位至胞核，特異性識別和結合基因啟動子,啟動和調控相關基因表達，在腫瘤的侵襲轉移、血管生成、增殖凋亡等過程中發揮重要作用〔9〕。胞外信號調控激酶(ERK)是真核生物中廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(MAPK)中的一種，通過整合素進入細胞核內，促進多種轉錄因子磷酸化，增強轉錄活性。

研究發現αvβ6與ERK2之間存在直接連接，結合位點位于746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764，因此腫瘤細胞可以將細胞外信號通過αvβ6-ERK2跨膜載體傳遞給細胞核內轉錄因子啟動相關基因表達(如Nr4a1基因)〔10〕。Nr4a1是早期反應基因家族中的一員，廣泛表達于各種組織，包括胸腺、肌肉、肺、肝等，接受細胞外刺激誘導后可以迅速表達，因細胞類型和刺激信號的不同對不同靶點特異性識別和結合調控相關基因的轉錄，參與細胞的存活與凋亡、代謝性疾病、血管重塑、類固醇合成、腫瘤發生以及炎性反應等。目前研究證實Nr4a1與肺癌的發生及轉移也存在密切的關系〔11〕。本研究中肺癌細胞經過Nr4a1拮抗劑處理后，細胞中αvβ6、ERK2 及p-ERK2蛋白的表達水平一致降低，而對照組中表達水平沒有變化，因此本研究中Nr4a1基因通過αvβ6-ERK2通路發揮作用。

至于αvβ6-ERK2通路傳遞的細胞外信號如何調控核內轉錄因子并影響下游Nr4a1基因，既往研究證實αvβ6-ERK2通路傳遞的細胞外信號激活了Ets1轉錄因子，并進入細胞核內，從而特異性識別相關基因啟動子，啟動相關基因的表達〔10〕。本研究發現，經Nr4a1拮抗劑處理后，間質表型標志分子的表達減低以及上皮表型標志分子表達升高，表明肺癌A549細胞出現了“間質-上皮轉化”的過程，Nr4a1拮抗劑抑制了肺癌A549細胞EMT過程。因此，我們推測當細胞外信號(如機體免疫能力差、化療耐藥、干細胞比例升高等)通過αvβ6-ERK2通路傳遞到細胞核內，通過Ets1轉錄因子啟動相關基因啟動子，誘導Nr4a1快速表達相關蛋白酶，降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的侵襲及轉移。

1 Nakai A,Kartha S,Sakurai A,etal.A human early response gene homologous to murine nur77 and rat NGFI-B,and related to the nuclear receptor superfamily〔J〕.Mol Endocrinol,1990;4(10):1438-43.

2 Hedrick E,Lee SO,Doddapaneni R,etal.NR4A1 antagonists inhibit beta1-integrin-dependent breast cancer cell migration〔J〕.Mol Cell Biol,2016;36:1383-94.

3 Hanna RN,Cekic C,Sag D,etal.Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung〔J〕.Science,2015;350(6263):985-90.

4 Zhou F,Drabsch Y,Dekker TJ,etal.Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling〔J〕.Nat Commun,2014;5:3388.

5 王海兵,張慧君，蘇晉梅，等.肺癌A549細胞上皮-間質轉化及其對微小RNA表達的影響〔J〕.中華腫瘤雜志，2011;33(8):590-3.

6 Ko H.Geraniin inhibits TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition and suppresses A549 lung cancer migration,invasion and anoikis resistance〔J〕.Bioorg Med Chem Lett,2015;25(17):3529-34.

7 Shao K,Chen ZY,Gautam S,etal.Posttranslational modification of E-cadherin by core fucosylation regulates Src activation and induces epithelial-mesenchymal transition-like process in lung cancer cells〔J〕.Glycobiology,2016;26(2):142-54.

8 Bates RC.The alphavbeta6 integrin as a novel molecular target for colorectal cancer〔J〕.Future Oncol,2005;1(6):821-8.

9 Yordy JS,Muise-Helmericks RC.Signal transduction and Ets family of transcription factors〔J〕.Oncogene,2000;19(55):6503-13.

10 彭 程，牛正川，王 奔，等.去甲斑蝥素阻斷αvβ6-ERK-ETS1信號通路抑制結腸癌細胞上皮-間質轉化實驗研究〔J〕.中國現代普通外科進展,2014;(17):757-62.

11 Zhou J,Wang J,Zeng Y,etal.Implication of epithelial-mesenchymal transition in IGF1R-induced resistance to EGFR-TKIs in advanced non-small cell lung cancer〔J〕.Oncotarget,2015;6(42):44332-45.

〔2016-04-15修回〕

(編輯 徐 杰)

Inhibition of epithelial mesenchymal transition of lung cancer cells via αVβ6-ERK-ETS1 beta pathway by Nr4a1 antibody

MAO Xiao-Liang,TONG Ji-Chun,ZHU Zheng,etal.

Department of Cardiothoracic Surgery,the Second People's Hospital of Changzhou,Changzhou 213000,Jiangsu,China

Objective To observe the effect of Nr4a1 antibody on the epithelial mesenchymal transition(EMT) of lung cancer cells in the αVβ6-ERK-ETS1 pathway.Methods Human lung cancer cell line A549 was cultured,and then divided into experimental and control groups. Growth factors were used for inducing epithelial mesenchymal transition process in two groups. Nr4a1 polyclonal antibody was added to blockade of αVβ6-ERK-ETS1 pathway in the experimental group while the control group was not. The flow cytometry technique and Western blot were used to detect signal pathway related protein expression,and compared between groups.Results The cells of experimental group were fusiform or similar to the morphology of fiber cells,while the control group cells were round or oval. The epithelial cell markers including E-cadherin,gamma catenin andαVβ6 were decreased significantly in control group cell,and stromal cells labeled compounds Nβ-cateinin,vimentin expression were increased (P<0.05). Conclusions The Nr4a1 polyclonal antibody could inhibit EMT of lung cancer cells by inhibiting the αVβ6-ERK-ETS1 pathway.

Nr4al polyclonal antibody;αVβ6-ERK-ETS1 pathway;Epithelial mesenchymal transition

國家自然科學基金(81171653)

童繼春(1965-)，男，主任醫師，主要從事胸腔鏡研究。

毛小亮(1973-)，男，副主任醫師，主要從事胸腔鏡研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0809-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.011

1 蘇州大學附屬第三醫院