地喹氯銨對腦膠質瘤細胞凋亡的影響

張芳芳 李 鑫 郭偉英

(錦州醫科大學藥學院，遼寧 錦州 121000)

地喹氯銨對腦膠質瘤細胞凋亡的影響

張芳芳 李 鑫1郭偉英

(錦州醫科大學藥學院，遼寧 錦州 121000)

目的 探討地喹氯銨對腦膠質瘤細胞增殖、凋亡及侵襲的影響。方法 用50、100、200 μmol/L的地喹氯銨作用于腦膠質瘤細胞U251、U87、C6，作用時間分別為12、24、48、72、96 h，MTT檢測細胞增殖情況。流式細胞儀檢測76 μmol/L的地喹氯銨作用48 h后的腦膠質瘤細胞U251的細胞凋亡情況。Transwell小室檢測地喹氯銨對腦膠質瘤細胞侵襲能力的影響。Western印跡檢測細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表達水平。結果 50、100、200 μmol/L的地喹氯銨對U251、U87、C6腦膠質瘤細胞增殖均具有抑制作用。地喹氯銨對腦膠質瘤細胞的增殖抑制作用隨著作用時間的增加而增加，隨著藥物作用濃度的增加而增加。地喹氯銨作用膠質瘤U251、U87、C6細胞48 h的半數抑制濃度由大到小依次為：C6>U87>U251。76 μmol/L的地喹氯銨作用后的腦膠質瘤細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.01)。腦膠質瘤細胞經地喹氯銨作用后的侵襲細胞數明顯低于對照組(P<0.01)。地喹氯銨作用后的腦膠質瘤細胞中PI3K、Akt的表達水平與對照組相比無明顯差異，而p-PI3K、p-Akt的表達水平明顯下降。結論 地喹氯銨對腦膠質瘤細胞增殖、侵襲能力具有抑制作用，對腦膠質瘤細胞凋亡具有促進作用，作用機制與PI3K/Akt信號通路有關。

地喹氯銨；腦膠質瘤；增殖；凋亡；侵襲

目前常用的治療腦膠質瘤的方法是手術治療和放療〔1〕，但由于腦膠質瘤具有發病隱匿、生長速度快、易轉移、易復發等特點，手術治療和放療效果仍然不理想。地喹氯銨(DECA)是一種廣譜抗菌藥，對分枝桿菌、革蘭陰性菌、革蘭陽性菌等具有抑制作用〔2〕，對口腔潰瘍、扁桃體炎、咽炎、白血病等都具有治療作用〔3〕。近年來的研究發現，DECA對膀胱癌、結腸癌細胞的增殖具有抑制作用〔4〕。本研究擬探討DECA對腦膠質瘤細胞增殖、凋亡、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人腦膠質瘤細胞U251、U87、C6購自上?；鄯f生物科技公司。

1.1.2 主要儀器及試劑 酶標儀，CO2培養箱，流式細胞儀，美國Thermo；水浴鍋，常州華冠儀器設備有限公司；超凈工作臺，蘇州施威克環?？萍加邢薰?；倒置顯微鏡，日本尼康；DMEM培養基、PI、Annexin-V、PVDF膜、MTT、青鏈霉素、胰蛋白酶，美國Sigma；胎牛血清(FBS)杭州四季青有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒，上海索萊寶生物科技有限公司；PI3K單克隆抗體，p-PI3K單克隆抗體，p-Akt單克隆抗體，Akt單克隆抗體，GAPDH單克隆抗體，美國Fitzgerald；辣根過氧化物標記的二抗，杭州聯科生物股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取出放置于-80℃冰箱中的凍存細胞，迅速放置于37℃水浴鍋中融化細胞。1 min后觀察細胞完全融化后，在細胞中加入5 ml含有10%FBS的DMEM細胞生長液，充分混合后，1 000 r/min離心10 min，在細胞中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，加入5 ml細胞生長液，接種于細胞培養瓶中，放在37℃，5%CO2培養箱中培養48 h。倒置顯微鏡下觀察細胞長滿后，棄去細胞生長液，在細胞中加入PBS洗滌細胞2次。加入1 ml的0.25%的胰蛋白酶，放在37℃，5%CO2培養箱中消化2 min。顯微鏡下觀察細胞完全呈單個存在時，轉移細胞懸液至離心管中。1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，在細胞沉淀中加入適量的細胞生長液，接種于細胞培養瓶中培養。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖情況 取培養至對數生長期的腦膠質瘤細胞U251、U87、C6，小心棄掉細胞生長液，用PBS洗滌細胞2次，加入胰蛋白酶消化細胞后，1 000 r/min離心10 min，在細胞中加入適量的細胞生長液，使得每毫升細胞懸浮液中含有細胞個數為2×104個。種植于96孔細胞培養板中，在37℃，5%CO2培養箱中培養24 h。棄去細胞培養液，在細胞中加入DECA終濃度為50、100、200 μmol/L的含藥培養基。放置于37℃，5%CO2培養箱中培養，培養時間分別為12、24、48、72、96 h。同時設置對照組和空白組，對照組中不加入DECA，加入等量的二甲基亞砜(DMSO)溶液。空白組中不加細胞，加入等量的藥物。在細胞中加入MTT溶液150 μl，充分混勻后，放置于37℃的CO2培養箱中孵育4 h。加入DMSO溶液孵育10 min后，酶標儀檢測每孔的吸光度。分析細胞增殖情況。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果 取處于對數生長期的腦膠質瘤細胞U251，加入胰蛋白酶消化細胞后，1 000 r/min離心10 min，在細胞沉淀中加入細胞生長液，接種于96孔細胞培養板中，調整細胞濃度使每孔中有2×105個細胞，放置于37℃，5%CO2培養箱中培養24 h。小心倒掉細胞生長液，在細胞中加入含有DECA終濃度為76 μmol/L的含藥培養基，放在37℃，5%CO2培養箱中培養48 h。同時設置對照組，對照組中用DMSO溶液代替DECA。培養結束后，棄去細胞生長液，在細胞中加入胰蛋白酶消化細胞后，用PBS洗滌細胞2次。加入PBS重懸細胞，細胞濃度為2×106個/ml。收集1 ml細胞懸液中的細胞，加入500 μl的結合緩沖液，吹打混勻后，在細胞中加入Annexin V和PI各5 μl，放在室溫下反應10 min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 取出保存于-20℃的Transwell小室，在室溫下放置30 min。在Transwell小室的下室加入不含FBS的細胞生長液，放置于37℃孵育2 h。取對數生長期的腦膠質瘤細胞U251，加入胰蛋白酶融化細胞后，1 000 r/min離心10 min，棄去酶消化液。在細胞沉淀中加入含有DECA 76 μmol/L不含胎牛血清的細胞生長液，使每毫升細胞懸液中含有4×104個細胞。在小室的下室加入500 μl的細胞生長液，在小室的上室加入細胞懸液600 μl，放在37℃，5%CO2培養箱中培養16 h。用棉簽擦掉Transwell小室內側的多余細胞，用結晶紫染色小室外側部分，顯微鏡下觀察細胞遷移情況。

1.2.5 Western印跡檢測細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表達情況 取經76 μmol/L DECA作用48 h后的腦膠質瘤細胞U251，棄去細胞生長液，在細胞中加入PBS洗滌細胞2次。加入細胞裂解液，充分混勻后，放置于冰上裂解40 min。4℃，12 000 r/min離心10 min后，轉移蛋白上清至新的EP管中。根據蛋白濃度檢測試劑盒說明書檢測提取的蛋白濃度。將提取的蛋白樣品與Loading buffer充分混合后，放在100℃的孵育器中煮沸5 min，使蛋白充分變性。取適量的變性蛋白樣品加入到上樣孔中，每孔加入50 μl，電泳初始電壓為80 V，電泳30 min后調整電壓至120 V至電泳結束。取出蛋白凝膠按照常規方法4℃電轉過夜。取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以5%脫脂奶粉為封閉液在37℃封閉90 min。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，依次與一抗、二抗孵育反應后，在暗室中曝光，分析蛋白表達含量。

1.3 統計學方法 應用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1 MTT檢測細胞增殖結果 50、100、200 μmol/L的DECA對U251、U87、C6腦膠質瘤細胞增殖均具有抑制作用。DECA對腦膠質瘤細胞的增殖抑制作用隨著作用時間增加而增加，隨著藥物作用濃度增加而增加。計算DECA作用U251、U87、C6細胞48 h的半數抑制濃度依次為(76.32±6.38)μmol/L、(89.65±9.47)μmol/L、(106.89±10.24)μmol/L。DECA作用于膠質瘤U251、U87、C6細胞48 h的半數抑制濃度由大到小依次為：C6>U87>U251。見圖1。

與0 μmol/L比較:1)P<0.05，2)P<0.01；下圖同圖1 DECA對腦膠質瘤細胞增殖影響結果

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 76 μmol/L的DECA作用后的腦膠質瘤細胞凋亡率〔(39.87±4.29)%〕明顯高于對照組〔(11.24±1.32)%〕(P<0.01)。

2.3 Transwell 小室檢測細胞侵襲結果 膠質瘤細胞經DECA作用后的侵襲細胞數(139±15)明顯少于對照組(342±21)(P<0.01)。

2.4 Western印跡檢測細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表達結果 DECA作用后的腦膠質瘤細胞中PI3K、Akt的表達水平與對照組相比無明顯差異，而p-PI3K、p-Akt的表達水平明顯下降。見圖2。

圖2 DECA對腦膠質瘤細胞蛋白表達的影響

3 討 論

由于腦膠質瘤具有易轉移、易復發等特點，手術治療和化療后患者的平均生存期僅有10個月〔5〕。

DECA屬于季銨類表面活性劑，是人工合成的含有兩個喹啉芳雜環的喹啉衍生物，具有廣泛的抑菌作用，早期主要用來治療口腔炎癥。DECA通過作用于微生物體內的相關蛋白酶調控其糖酵解的過程，發揮殺菌抑菌的作用〔6〕。DECA對肺癌細胞具有明顯的增殖抑制作用，通過調控凋亡相關因子促進癌細胞的凋亡〔7〕。

細胞以分裂的方式進行增殖。正常情況下，細胞增殖和細胞凋亡是一個動態平衡的過程〔8〕。細胞凋亡是一種自然狀態下的細胞死亡。這種死亡受多種基因嚴格調控，由多種因子共同作用經過一系列復雜的過程而產生的。細胞凋亡是機體維持內環境穩定的一種方式，是多細胞生命體消除多余或者異常細胞的一種重要途徑〔9〕。在癌癥的發生過程中，癌細胞的侵襲能力是癌癥發展的重要前提，是腫瘤向周圍組織侵犯的過程〔10〕。本研究中，MTT檢測結果顯示，DECA對腦膠質瘤細胞增殖具有抑制作用，且對腦膠質瘤細胞的增殖抑制作用隨著作用時間和作用濃度的增加而增加。流式細胞儀檢測結果顯示，DECA對腦膠質瘤細胞凋亡具有促進作用。Transwell小室檢測結果說明，DECA對腦膠質瘤細胞的侵襲能力具有明顯的抑制作用。

在細胞增殖凋亡侵襲過程中，多種蛋白參與了這一系列復雜的過程，其中磷酸肌醇激酶(PI3K)/Akt信號通路在癌細胞增殖、凋亡、侵襲過程中發揮重要作用〔11〕。PI3K是一種原癌基因，可以激活磷脂酰肌醇和肌醇〔12〕。Akt是蛋白激酶B的另一種叫法〔13〕。這兩種激酶組成的PI3K/Akt信號通路參與癌細胞的增殖、凋亡和侵襲過程〔14〕。Western印跡結果說明，DECA對腦膠質瘤細胞的作用機制是通過抑制PI3K/Akt信號通路作用的。

綜上所述，DECA對腦膠質瘤細胞增殖、侵襲具有抑制作用，對腦膠質瘤細胞凋亡具有促進作用，作用機制與PI3K/Akt信號通路有關。

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〔2016-06-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

遼寧省自然科學基金(No.2014022044)

郭偉英(1958-)，男，教授，碩士，主要從事藥物分析研究。

張芳芳(1985-)，女，在讀碩士，主要從事藥學研究。

R739.4

A

1005-9202(2017)04-0822-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.016

1 錦州醫科大學附屬第一醫院藥品管理科