被動吸煙對大鼠血清和肺組織中白細胞介素17表達的影響

梁會朋 韓書芝 平 芬

(河北省人民醫院呼吸內科，河北 石家莊 050051)

被動吸煙對大鼠血清和肺組織中白細胞介素17表達的影響

梁會朋1韓書芝 平 芬

(河北省人民醫院呼吸內科，河北 石家莊 050051)

目的 觀察被動吸煙和戒煙對大鼠被動吸煙模型血清和肺組織中白細胞介素(IL)-17變化的影響。方法 選擇健康雄性Wistar大鼠50只，隨機分為5組，分別為正常對照組、被動吸煙4 w、8 w、12 w組和戒煙組。HE染色觀察肺組織的病理改變，采用ELISA方法檢測血清中IL-17含量，免疫組織化學染色方法觀察肺組織中IL-17的表達。結果 被動吸煙可導致肺組織炎癥反應和肺氣腫改變；被動吸煙組和戒煙組大鼠血清IL-17含量較正常對照組升高，肺組織中 IL-17表達增強；隨著被動吸煙時間的延長，血清中IL-17含量逐漸增加，肺組織中IL-17表達逐漸增加；戒煙組較被動吸煙12 w組血清IL-17含量降低，肺組織中IL-17表達減少。結論 被動吸煙可引起肺部炎癥，導致血清及肺組織IL-17表達增加，IL-17可能參與了吸煙相關性肺損傷的發生。

被動吸煙；戒煙；肺損傷；白細胞介素17

香煙燃燒產生的煙霧是由氣體和懸浮顆粒組成的氣溶膠，包含大量氧化劑和多種有毒物質，如尼古丁、焦油、苯并芘等，這些有毒物質進入氣道，引起呼吸道黏膜損傷，導致機體炎癥反應增強。白細胞介素(IL)-17是近年來人們發現的一種新的細胞因子，主要由Th17細胞產生，是一種促炎性細胞因子，也是炎癥反應的早期啟動子，因其在誘導炎癥方面具有強大的作用而備受重視。本研究通過建立被動吸煙大鼠模型，檢測其血清和肺組織IL-17的表達，探討IL-17在被動吸煙導致肺損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠50只，體重150 g左右，由河北醫科大學實驗動物中心提供，實驗過程中動物飼養及取材均遵守實驗動物管理和保護的有關規定。將動物隨機分為5組：正常對照組、被動吸煙4 w、8 w、12 w組和戒煙組(戒煙組即被動吸煙8 w后戒煙8 w組)，每組10只。實驗前適應性喂養1 w。將各被動吸煙組大鼠置于自制70 cm×60 cm×40 cm熏煙箱〔1〕內，每次燃燒15支香煙(鉆石牌香煙，焦油量：11 mg，煙氣煙堿量1.0 mg)，持續1 h；每天2次，2次間隔時間>6 h，每周7 d。戒煙組大鼠接受被動吸煙8 w后開始戒煙，同正常對照組置于無煙環境中飼養。

1.2 實驗方法

1.2.1 HE染色 各實驗組大鼠分別在規定的日期，禁食12 h，采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，留取右肺下葉組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片(片厚約3～4 μm)，用于HE染色，觀察肺組織病理變化。

1.2.2 IL-17免疫組織化學染色 每只大鼠肺組織標本取一張切片，用于IL-17免疫組織化學染色(IL-17抗體購于美國Santa Cruz公司，過氧化物酶標記鏈霉卵白素染色二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2.3 血清IL-17測定 取大鼠腹主動脈血4～8 ml，靜置1 h，離心取上清，用于IL-17 ELISA檢測(試劑盒購于BlueGene公司)，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1 肺組織病理改變 正常對照組大鼠氣道和肺組織結構完整，無明顯病理改變。各被動吸煙組和戒煙組大鼠肺組織出現不同程度的損傷，隨著被動吸煙持續時間的增加，肺損傷的程度逐漸加重。被動吸煙4 w組可見到氣道黏膜上皮細胞出現壞死、脫落；氣道壁和肺組織可見炎性細胞浸潤，主要為中性粒細胞和巨噬細胞。被動吸煙8 w組除了上述改變外，氣道黏膜上皮細胞受損程度加重，杯狀細胞增生，黏液分泌增多，氣道平滑肌增生肥大，肺泡壁擴張、變薄，充氣增多。被動吸煙12 w組可見肺泡壁進一步變薄，部分斷裂融合，呈現顯著肺大泡、肺氣腫改變；肺組織可見炎性細胞浸潤明顯，以淋巴細胞和巨噬細胞為主。戒煙組仍可觀察到炎癥細胞浸潤及肺氣腫表現，但與被動吸煙12 w組比較，損傷減輕。見圖1。

2.2 肺組織IL-17的表達 免疫組織化學染色顯示，正常對照組大鼠氣道上皮細胞可見有少量IL-17表達；各被動吸煙組大鼠氣道上皮細胞IL-17表達增強，在肺泡上皮細胞也可見IL-17表達，且隨著被動吸煙持續時間的增加，氣道上皮細胞及肺泡上皮細胞IL-17表達逐漸增強，顏色加深；被動吸煙12 w組表達最明顯，呈棕褐色，幾乎充滿整個上皮細胞。戒煙組大鼠氣道上皮細胞及肺泡上皮細胞仍可見IL-17明顯表達，但較被動吸煙12 w組表達減弱。見圖2。

2.3 血清IL-17含量 正常對照組大鼠血清中IL-17含量〔(98.99±12.26)pg/ml〕與被動吸煙組大鼠血清IL-17含量比較顯著升高(P<0.01)。隨著被動吸煙時間的延長(4 w、8 w、12 w)，血清中IL-17含量逐漸升高〔(118.29±15.71)、(148.99±17.01)、(175.70±15.40)pg/ml，P<0.01〕。戒煙組血清中IL-17含量〔(151.31±20.61)pg/ml〕較正常對照組升高(P<0.01)。戒煙組與被動吸煙8 w組比較IL-17含量輕度增加(P>0.05)。戒煙組與被動吸煙12 w組比較，血清中IL-17含量下降(P<0.05)。

圖1 肺組織病理改變(HE，×100)

圖2 肺組織IL-17免疫組化表達(DAB，×200)

3 討 論

香煙煙霧中含有數千種化學物質，如尼古丁、焦油、一氧化碳、自由基、鎘、汞、鉛、砷以及甲醛、苯并芘等，大部分有毒物質隨香煙煙霧被吸入肺部，對肺組織造成嚴重危害。研究證實被動吸煙使支氣管炎、慢性支氣管炎、呼吸困難發生的危險性增高；被動吸煙還能夠引起肺功能下降，且具有劑量依賴性〔2〕。給予多次被動吸煙后小鼠體內細胞因子如巨噬細胞趨化因子(MCP-1)、粒單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-8水平明顯升高。GM-CSF、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β隨吸煙時間延長和吸煙劑量增加呈現上升趨勢，與吸煙具有量效關系〔3〕，提示炎癥反應參與了吸煙導致的肺臟損傷。IL-17是新發現的一種細胞因子，主要由Th17細胞產生。IL-17與其受體結合，主要通過NF-κB-DNA途徑和有絲分裂原激活激酶(MAPK)途徑發揮其生物學作用〔4〕。IL-17能誘導IL-8、 IL-6 、TNF-α等多種細胞因子和炎性介質的產生，導致機體產生強烈的炎癥反應。而IL-8、IL-6 、TNF-α在吸煙導致肺損傷的發病機制中具有重要作用〔5〕。 IL-17還可通過促進C-X-C趨化因子誘導中性粒細胞活化和募集，促進氣道炎癥反應，參與肺損傷〔6，7〕。本實驗提示IL-17可能參與了被動吸煙導致肺損傷的發病機制。

有研究顯示吸煙COPD患者的IL-17 mRNA的表達明顯高于吸煙肺功能正常者和非吸煙者，IL-17 mRNA與一秒率FEV1%呈負相關〔8〕。對吸煙小鼠注射IL-17抗體發現：抗體處理組小鼠肺泡灌洗液中總細胞計數較吸煙組降低，中性粒細胞比例較單純吸煙組明顯下降，氣道炎癥減輕。肺組織中的IL-17水平較單純吸煙組顯著降低〔9，10〕，說明IL-17抗體與IL-17結合后降低了IL-17導致的氣道和肺臟的炎性反應，減輕了肺損傷程度。

有研究顯示吸煙的COPD患者戒煙后12 h血中一氧化碳(CO)的含量就會恢復正常，2 w至3個月肺功能得到改善，1～9個月咳嗽及呼吸短促的發生減少、氣道纖毛恢復正常功能〔11〕。Godtfredsen等〔12〕認為戒煙可以減輕呼吸道癥狀，減輕肺部炎癥，延緩肺功能下降速度。本研究進一步證實IL-17參與了被動吸煙導致的肺損傷。實驗發現戒煙后炎癥反應仍在持續，但較持續被動吸煙組炎癥反應程度降低，說明戒煙能緩解煙草煙霧引起的炎癥反應。吳卓等〔13,14〕分別對不同吸煙時間造成的肺部炎癥、肺氣腫、COPD大鼠模型進行觀察發現：無論是在早期肺部炎癥階段開始戒煙，還是在肺氣腫、COPD形成后開始戒煙，戒煙早期肺部的炎癥較正常不吸煙組明顯升高，與戒煙前比較，炎癥反應仍可見加重；但隨著戒煙時間的延長，可見到肺部的炎癥反應指標的降低和肺功能改善，與本實驗結果相似。

綜上，吸煙可導致肺損傷，戒煙雖不能使肺損傷逆轉，但可延緩肺損傷進一步發展的速度。吸煙導致肺損傷的機制十分復雜，有待繼續深入研究。

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8 Zhang J,Chu S,Zhong X，etal.Increased expression of CD4+IL-17+cells in the lung tissue of patients with stable chronic obstructive pulmonary disease(COPD)and smokers〔J〕.Int Immunopharmacol,2013;15(1):58-66.

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12 Godtfredsen NS,Lam TH，Hansel TT,etal.COPD-related morbidity and mortality after smoking cessation:status of the evidence〔J〕.Eur Respir J,2008;32(4):844-53.

13 吳 卓,姜洪芳,田大力,等.戒煙對慢性阻塞性肺病模型大鼠肺組織病理及肺功能的影響〔J〕.中國老年學雜志,2011;31(4):646-8.

14 姜洪芳,蔡存偉,趙 立.早期戒煙大鼠肺病理及炎性介質變化〔J〕.中國比較醫學雜志,2012;22(1):51-3.

〔2015-07-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省衛生廳科研基金項目(20130107)

韓書芝(1965-)，女，教授，碩士生導師，主要從事呼吸系統疾病研究。

梁會朋(1985-)，女，碩士，住院醫師，主要從事呼吸系統疾病研究。

R563.9

A

1005-9202(2017)04-0834-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.021

1 河北省胸科醫院呼吸內科