左乙拉西坦治療癲癇模型大鼠癇性發作的療效及可能機制

周艷輝 劉春苗 林 珍 王 琦 余 丹

(海口市人民醫院神經內科，海南 海口 570208)

左乙拉西坦治療癲癇模型大鼠癇性發作的療效及可能機制

周艷輝 劉春苗 林 珍1王 琦1余 丹

(海口市人民醫院神經內科，海南 海口 570208)

目的 探討左乙拉西坦治療癲癇模型大鼠癇性發作的療效及作用機制。方法 將40只健康成年的Wistar大鼠按性別體重均衡隨機分為空白對照組，模型組，甘珀酸組和左乙拉西坦組，每組10只。除空白對照組外，其余每組大鼠采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇大鼠模型，造模前甘珀酸組大鼠提前30 min給予甘珀酸20 mg/kg腹腔注射，左乙拉西坦組提前60 min給予左乙拉西坦0.3 g/kg灌胃，模型組大鼠給予等量的生理鹽水。造模成功后持續監測腦電圖，觀察并記錄各組大鼠首次癇性發作的時間以及造模后2、12、24 h發作時的行為表現次數，觀察結束后取斷頭取腦，應用RT-PCR和Western印跡檢測海馬組織縫隙連接蛋白(Cx)43 mRNA和Cx43蛋白表達的變化。結果 與模型組比較，甘珀酸組和左乙拉西坦組大鼠腦電壓均顯著下降(P<0.01)；甘珀酸組和左乙拉西坦組大鼠腦電頻率A和B均呈遞增趨勢，其中甘珀酸組大鼠腦電頻率A和左乙拉西坦組大鼠腦電頻率B變化顯著(P<0.05)；與模型組比較，甘珀酸組和左乙拉西坦組大鼠癲癇發作潛伏期均明顯延長(P<0.01)，且隨著時間點的后延，各組大鼠癇性發作次數均逐漸減少，但與模型組比較，甘珀酸組和左乙拉西坦組減少均顯著(P<0.05或P<0.01)。與空白對照組大鼠比較，其余各組大鼠海馬組織Cx43蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組大鼠比較，甘珀酸組和左乙拉西坦組大鼠海馬組織Cx43蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。與空白對照組大鼠比較，其余各組大鼠海馬組織Cx43 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組大鼠比較，甘珀酸組和左乙拉西坦組大鼠海馬組織Cx43 mRNA表達水平均顯著下降(P<0.01)。結論 左乙拉西坦能有效控制癲癇大鼠的癇性發作，其機制可能與抑制大鼠海馬組織Cx43的表達有關。

左乙拉西坦；癲癇；海馬組織

癲癇是人體的大腦神經元因突發性異常放電而導致的大腦功能短暫性障礙，屬慢性疾病，是人體發作性意識喪失的常見原因之一。部分癲癇患者伴有一定程度的認知功能障礙，但具體病因目前尚不清楚〔1〕。該病的治療臨床上主要以西藥為主，但傳統的抗癲癇藥物副作用較大，本身易致患者出現認知功能損害〔2〕。甘珀酸具有廣泛的縫隙連接阻斷功能，是一種已知的有效抗癲癇藥物；左乙拉西坦(LEV)屬于吡咯烷酮類的新型抗癲癇藥物。國內外研究表明，本品具有廣譜、起效迅速、改善患者認知功能等特點，其作用不通過阻斷離子通道或調節神經遞質而實現，但具體作用機制尚不明確〔3〕。本文通過動物實驗進一步觀察LEV對癲癇大鼠癇性發作的療效，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 Wistar大鼠，SPF級，雌雄兼用，體重180～220 g，購于西安交通大學醫學院實驗動物中心，質量合格證編號：SCXK(陜)2015-0001-0001467；SPF級飼料(購于北京維通利華實驗動物技術公司)喂養，自由飲水，適應性飼養3 d后進行相關實驗，實驗場所：西安交通大學醫學院動物實驗中心。

1.2 試劑與藥品 氯化鋰-匹羅卡品及甘珀酸，購于美國sigma-aldrich公司；二喹啉甲酸，購于比利時UCB Pharma S.A.公司。異氰硫酸熒光素(FITC)標記兔抗大鼠縫隙連接蛋白(Cx)43多克隆抗體，購于北京博奧森生物技術有限公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG(H+L)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術有限公司)，PCR試劑盒、RT-PCR試劑盒(Qiagen公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司)。

1.3 主要儀器 ME-175E-W腦電圖機(日本光電公司)，NT9216型腦電分析系統(北京新拓儀器研究所)。

1.4 實驗分組及癲癇大鼠模型制備 將40只健康成年的Wistar大鼠按性別、體重均衡隨機分為空白對照組，模型組，甘珀酸組和LEV組，每組10只。參照文獻〔4〕并結合預實驗，除空白對照組外(在各給藥時間點給予等量的生理鹽水)，其余各組大鼠先給予腹腔注射氯化鋰120 mg/kg，間隔18～20 h后給予東莨菪堿1.5 mg/kg腹腔注射，30 min后再給予匹羅卡品80 mg/kg腹腔注射。在腹腔注射匹羅卡品前模型組不做特殊處理，甘珀酸組大鼠提前30 min給予腹腔注射甘珀酸20 mg/kg，LEV組大鼠提前60 min給予灌胃LEV 0.3 g/kg。模型成功與否的判斷標準參照Racine分級〔5〕，如果出現Ⅲ級及以上發作，即可視為模型成功；未達到Ⅲ級大鼠繼續注射氯化鋰-匹羅卡品直至次數達到5次，5次后仍未達到標準的，視為造模不成功〔6〕，其中0級為無癲癇發作；Ⅰ級為面部陣攣、閉眼、須動、哈欠；Ⅱ級為在Ⅰ級基礎上出現節律性點頭、頸部肌肉抽動；Ⅲ級為在Ⅱ級基礎上出現前肢或后肢單側肢體抽動；Ⅳ級為在Ⅲ級基礎上出現多肢抽動、痙攣并伴后肢站立；Ⅴ級為在Ⅳ級基礎上出現全面性強直陣攣發作或跌倒。出現癲癇持續狀態并持續發作1 h，給予地西泮腹腔注射止痙(10 mg/kg)。造模后各組大鼠均符合癲癇模型成功判定標準，造模成功。部分大鼠有追加注射氯化鋰-匹羅卡品，各組追加動物數及追加次數：模型組2只大鼠分別追加1次和2次，甘珀酸組3只大鼠各追加1次，LEV組2只大鼠各追加2次。

1.5 檢測方法及觀察指標

1.5.1 腦電圖及行為學觀察〔7〕觀察并記錄各組大鼠首次癇性發作的時間，造模后2、12、24 h發作時的行為表現次數；同時，各組大鼠于造模成功后70 min開始監測清醒狀態下10 min內的腦電圖情況。測定前將大鼠固定在固定器(自制)中，以單極導聯法在腦中線區兩耳之間(頂中線區和Pz區)插入一針電極至皮層下，連接F3導電極線，左耳電極夾在左耳上，大鼠尾部以針電極接地。定標：50 μV/5 mm，時間常數：0.3 s，走紙速度：30 mm/s，濾波：30 Hz，增益：×1.0。腦電圖監測采用NT9216型腦電分析系統中的平均參數功能，采用電壓高低反映波幅的大小，以頻率A分析δ、θ、α波，以頻率B分析β波。

1.5.2 Western印跡法檢測大鼠海馬組織Cx43表達〔8〕觀察24 h后將大鼠斷頭開顱取腦(在冰袋上進行)，稱取海馬組織100 mg，放入加有10 ml蛋白酶抑制劑的1 000 ml蛋白裂解液中低溫4℃下充分勻漿，高速離心后可得胞膜蛋白及胞質。繪制標準曲線，采用BCA法測算Cx43蛋白濃度。變性后取100 mg進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，分離后取蛋白轉至PVDF膜，用含有5%牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉30 min，然后用含有1%BSA的PBS液按照1∶500比例稀釋兔抗Cx43，4℃孵育過夜。羊抗兔IgG(1∶500)與ABC復合物在室溫下反應1 h，然后用Vigor-12C圖像掃描儀測灰度值。

1.5.3 RT-PCR法檢測大鼠海馬組織Cx43 mRNA表達〔9〕所有的操作均按照試劑盒說明的步驟進行，先稱取4 mg逆轉錄成cDNA；取2 μl cDNA配成25 μl體系進行PCR擴增，反應程序條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、30 s；72 ℃、10 min，4℃放置。PCR結束后每管加入6×上樣緩沖液4 ml，充分混勻，取5 ml PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果用Quantity one軟件分析灰度比值。Cx43上游引物：5'-TTA AGG AGA ACC-3'，下游引物：5'-CCC TCG TTG TTC-3'；β-actin上游引物：5'-GAA ATG ACC AT-3'，下游引物：5'-GCT TAA CAG GCC TA-3'。

1.6 統計學方法 采用SPSS21.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 腦電圖及行為學觀察 通過監測腦電圖可知，空白對照組大鼠腦電電壓在13～30 mV之間，腦電頻率由較少、基本無節律的α波、較多散發的β波和雜亂的θ波共同組成。與空白對照組比較，其余各組大鼠腦電電壓顯著升高(P<0.05)，腦電頻率A呈減慢趨勢(P<0.05)，腦電頻率B亦呈減慢趨勢(P<0.05)；與模型組比較，甘珀酸組和LEV組大鼠腦電電壓均顯著下降(P<0.01)，腦電頻率A和B均呈遞增趨勢，其中甘珀酸組大鼠腦電頻率A和LEV組大鼠腦電頻率B變化顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦電電壓、腦電頻率A、 腦電頻率B的比較

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.2 各組癲癇發作潛伏期及行為表現次數比較 除空白對照組外，其余各組大鼠均出現癲癇；與模型組比較，甘珀酸組和LEV組的大鼠癲癇發作潛伏期明顯延長(P<0.01)。發作后2、12、24 h，隨著時間點的后延，各組大鼠癇性發作次數均逐漸減少；與模型組比較，甘珀酸組和LEV組均顯著性減少(P<0.05或P<0.01)；與甘珀酸組比較，LEV組減少更顯著，但無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠癇性發作潛伏期、行為表現次數比較±s,n=10)

2.3 大鼠海馬組織Cx43 mRNA及蛋白表達 與空白對照組大鼠比較，其余各組大鼠海馬組織Cx43 mRNA蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組大鼠相比，甘珀酸組和LEV組大鼠海馬組織Cx43 mRNA及蛋白表達水平均明顯下降(P<0.05)，但兩組間比較無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織Cx43蛋白、 Cx43 mRNA表達情況

3 討 論

LEV屬于吡咯烷類衍生物，口服給藥具有不受食物影響，吸收迅速完全，生物利用度高，血漿蛋白結合率低，不經過肝臟代謝直接以原型由腎臟排泄〔10〕。關于LEV抗癲癇的作用機制文獻報道較多，大量研究表明〔11〕，該藥與其他抗癲癇藥物作用機制不同，主要通過結合中樞神經內突觸囊泡蛋白(SV2A)調節突觸內囊泡的胞外分泌功能和突觸前神經遞質的釋放。有研究指出〔12〕，癲癇患者腦內星形膠質細胞Cx 43表達呈上調趨勢，且上調程度與致癇時間長短呈正相關。采用熒光標記的膠原纖維酸性蛋白(GFAP)及采用抗體標記的健康人海馬組織研究表明，癲癇患者星形膠質細胞耦聯的損害呈擴大趨勢，星形膠質細胞表達增加，表明星形膠質細胞的上調會加重全面性癲癇發作〔13〕；而海人酸所致癲癇模型大鼠的大腦皮質與海馬均呈陽性，并與致癇時間呈顯著正相關，由此可知，星形膠質細胞參與了癲癇的發生及發展過程。也有學者提出，LEV抗癲癇作用機制可能與GABA受體敏感性有關；LEV可以通過有效阻斷電壓依賴性鈉離子通道，降低癲癇樣放電產生的電位數目，縮短放電持續時間，對鈣離子通道有輕微的阻滯作用〔14〕。

有研究表明，甘珀酸能夠通過阻斷縫隙連接的電擴布網絡而治療癲癇。甘珀酸通過直接與Cx結合，使之結構發生改變而使通道關閉，對Cx產生阻斷作用。藥理學研究表明，甘珀酸可縮短癲癇大鼠癇性發作的持續時間，降低癇性放電幅度，具有較明確的抗癲癇作用。本研究選用甘珀酸干預癲癇大鼠有效，與上述結果相一致〔15〕。

本研究結果表明LEV能顯著降低癲癇大鼠腦電電壓、增加腦電頻率、延長癇性發作潛伏期、減少癇性發作次數、抑制海馬組織Cx43蛋白和mRNA表達，提示LEV對癲癇大鼠癇性發作有良好的預防和控制作用。因Cx43是神經元和星形膠質細胞間的主要縫隙連接蛋白之一，其表達增多可造成神經元和星形膠質細胞間電耦聯活動增強進而誘發癲癇，故推測LEV控制癲癇機制可能與降低海馬組織Cx43蛋白和mRNA表達水平有關。

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〔2016-02-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

周艷輝(1980-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事腦血管病臨床研究。

R749

A

1005-9202(2017)04-0836-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.022

1 海口市人民醫院老年病科