老年糖尿病腎病患者血漿差異蛋白的表達

傅明捷 王衍慧 李 靜 傅君舟 黃玉宇 黃 萍 趙路寧

(廣州市第一人民醫院老年病科，廣東 廣州 510180)

老年糖尿病腎病患者血漿差異蛋白的表達

傅明捷 王衍慧 李 靜 傅君舟 黃玉宇 黃 萍 趙路寧1

(廣州市第一人民醫院老年病科，廣東 廣州 510180)

目的 探討老年糖尿病腎病(DN)與健康人群血漿差異蛋白的表達。方法 選取老年DN患者10例(試驗組)，同期查體健康人群10例(對照組)，采用熒光差異雙向凝膠電泳(2D-DIGE)檢測老年DN患者及健康志愿者血漿蛋白質組的表達情況，以差異表達1.5倍為截斷值挑選蛋白質斑點并行質譜分析。結果 應用老年DN患者及健康志愿者血漿成功構建差異表達雙向凝膠電泳圖譜，并分析篩選出33個差異表達斑點，通過質譜分析數據庫比對鑒定出6種差異表達蛋白。結論 2D-DIGE技術可有效篩選老年DN相關特異蛋白，為進一步篩選DN血清標志物提供依據。

糖尿病腎病；血漿蛋白；蛋白質組

糖尿病腎病(DN)為糖尿病(DM)最常見并發癥，已成為我國面臨的嚴重公共衛生問題〔1，2〕。本研究擬用DN患者與健康人群血清蛋白為研究材料，采用熒光差異雙向凝膠電泳(2D-DIGE)技術與基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術相結合，進行動態蛋白質組學研究分析，篩選出DN特異表達的蛋白，并對感興趣的蛋白進行生物功能的鑒定，從分子角度闡明DN的生物學基礎和機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年10月至2014年5月廣州市第一人民醫院老年病科住院的老年DN患者10例(試驗組)，男8例，女2例；年齡60～80歲。同一時間內健康志愿者10例(對照組)男8例，女2例；年齡60～80歲。兩組患者年齡及性別完全匹配。納入標準：患者24 h尿蛋白排出>500 mg；年齡60～80歲；血肌酐≤140 μmol/L；知情同意者。排除標準：腎小球濾過率<30%；血肌酐>140 μmol/L；心衰患者、人獲得性免疫缺陷病毒(HIV)陽性者、孕產婦。

1.2 主要試劑與儀器 過硫酸銨；二硫蘇糖醇(DTT)；血清去高分度蛋白試劑盒；超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；等電聚焦儀。

1.3 方法 血清的采集及處理：清晨空腹抽取上述兩組患者靜脈血10 ml，速凍存于液氮中，再置于-70℃保存，備雙向電泳及質譜分析用。雙向電泳及質譜分析 提取兩組人員血清總蛋白，用2D Quant Kit蛋白質定量試劑盒測定總蛋白濃度。每組取25 μg充分混合(內參)，50 μg內參用400 pmol Cy2標記，分別Cy3和Cy5標記，避光置于冰上放置半小時，再加1 μl亮氨酸(10 mmol/L)中止反應10 min。上樣，30 V水化13 h，然后經過100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h，8 000 V等電聚焦8.5 h。最后對膠條進行掃描并獲取清晰的圖像用于后處理分析。首先對獲得的圖像結果應用ImageMaster 5.0進行圖像分析處理，并獲得數據，進而采用Graphpad5.0軟件進行相關數據處理。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

以健康人為參照，DN患者上調或下調1.5倍為截斷值，同時滿足P<0.05的差異斑點有33個。軟件檢測對獲得的結果選定12個挖點進行膠內酶切，并行質譜分析，經檢索相關數據庫，比對鑒定出6種蛋白質，見表1。其中血清甲狀腺素運載蛋白和血液結合素和匹配率最高，分別為49%和20%。血液結合素(B28)及血清甲狀腺素運載蛋白(A41)肽指紋圖譜見圖1。

表1 篩選出的差異表達蛋白

圖1 肽指紋圖譜

3 討 論

DN血清蛋白質組學方面的研究也取得了一定的進展，可以在一定程度上彌補腎組織和尿液蛋白質組學研究的局限性〔3，4〕。Kim等〔5〕研究發現細胞外谷胱甘肽過氧化物酶和載脂蛋白E在微量白蛋白尿(MA)和慢性腎衰竭(CRF)組血清中的表達進行性減少，可以作為2型DN的生物標志物。Overgaard等〔6〕利用SELDI-TOF-MS研究了單純1型糖尿病、1型糖尿病伴微白蛋白尿、1型糖尿病伴大量白蛋白尿三組患者的血清蛋白表達譜變化。發現三組Apo A1的表達水平均下調，其中第三組的下降最為顯著。Apo C1在三組的表達水平均下調，其中第三組的下降具有顯著差異(P=0.012)。transthyretin和cystatin C在第三組的表達水平較其他組均有顯著差異(P<0.000 1)，但第一、第二組間表達水平無顯著差異。因此，血清Apo A1、Apo C1、transthyretin和cystatin C的表達變化可輔助評估1型糖尿病的腎臟病變程度。以上DN蛋白質組學研究取得了很多進展與突破，初步揭示了DN的部分分子機制，發現了一些與DN相關的蛋白，但這些研究仍然存在不同程度的缺陷與不足：①大部分研究在結果分析時僅采用t檢驗，由于重復比較次數太多，極大地增加了犯1類錯誤的概率，使得結果的可靠性較差。②缺乏動態研究，DN的發展進程中，蛋白質表達是一個高度動態變化的過程，單一個時間點的研究無法獲得系統全面的蛋白變化信息。③某些蛋白質組學研究的分辨率太低，導致發現有意義差異蛋白的概率也大大降低，如高糖環境下的系膜細胞研究，雖然采用了亞蛋白質組學方法也只獲得了214個蛋白〔7，8〕。本研究采用血漿蛋白質組學技術，應用熒光差異雙向凝膠電泳初步篩選出了老年DN患者與正常人群差異表達的血漿蛋白，為下一步進行的前瞻性大規模臨床對照研究提供了一定的理論和實踐依據。下一步有望通過Western技術在較大人群中進行驗證，并確定DN的特異性血漿蛋白標志物。

1 郭曉蕙，樓青青.我國糖尿病教育的問題與思考〔J〕.中華內科雜志，2011；50(1)：6-7.

2 Parving HH，Lewis JB，Ravid M，etal.Prevalence and risk factors for microalbuminuria in a referred cohort of type 2 diabetic patients：a global perspective〔J〕.Kidney Int，2006；69(11)：2057-63.

3 Sharma V，Tikoo K.Stage-specific quantitative changes in renal and urinary proteome during the progression and development of streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats〔J〕.Mol Cell Biochem，2014；388(1-2)：95-111.

4 Zubiri I，Posada-Ayala M，Sanz-Maroto A，etal.Diabetic nephropathy induces changes in the proteome of human urinary exosomes as revealed by label-free comparative analysis〔J〕.J Proteomics，2014；96(2)：92-102.

5 Kim HJ，Cho EH，Yoo JH，etal.Proteome analysis of serum from type 2 diabetics with nephropathy〔J〕.J Proteome Res，2007；6(2)：735-43.

6 Overgaard AJ，Hansen HG，Lajer M，etal.Plasma proteome analysis of patients with type 1 diabetes with diabetic nephropathy〔J〕.Proteome Sci，2010；8(1)：4.

7 Blutke A.Opening a treasure chest：glomerular proteome analyses of formalin-fixed paraffin-embedded kidney tissue in the investigation of diabetic nephropathy〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2012；27(5)：1695-8.

8 Papale M，Di PS，Magistroni R，etal.Urine proteome analysis may allow noninvasive differential diagnosis of diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes Care，2010；33(11)：2409-15.

〔2015-09-25修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

廣東省科技廳項目(2012B031800329)

黃 萍(1961-)，女，主任醫師，主要從事老年糖尿病研究。

傅明捷(1964-)，女，主任醫師，主要從事老年糖尿病及其并發癥研究。

R589.1

A

1005-9202(2017)04-0892-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.048

1 廣州醫科大學實驗醫學研究中心