分子生物學(xué)技術(shù)在白血病診斷中的應(yīng)用

孫園園　徐琳琳

【中圖分類號】R96 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）02--01

白血病是一種常見的基于造血干細(xì)胞惡性發(fā)生的腫瘤疾病。據(jù)報道，在中國地區(qū)白血病的死亡率占惡性腫瘤中的第六位，死亡率占兒童腫瘤的第一位。白血病是一組臨床異質(zhì)性疾病，根據(jù)患者年齡不同，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遺傳學(xué)異常程度不同預(yù)后和存活率有顯著差異，因此對于白血病早期診斷，準(zhǔn)確評估和治療都有很重要的意義。傳統(tǒng)白血病診斷方法以形態(tài)學(xué)檢測為主要手段，由于其主觀因素影響大，速度慢，精度、重復(fù)率不高，容易誤診或漏診?，F(xiàn)代診斷方法為形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)綜合診斷，即MICH方法。隨著臨床研究的不斷深入，分子生物學(xué)技術(shù)以其簡單，快速，敏感，特異，試劑穩(wěn)定，危害性小的顯著優(yōu)勢，在診斷、治療白血病，監(jiān)測微小殘留病的應(yīng)用中發(fā)揮了重要作用，為白血病精細(xì)分層[1]實現(xiàn)個體化治療[2]，提高患者的治療效果提供了重要依據(jù)。應(yīng)用于白血病的診斷分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為一個熱門話題，在本文中，將對最近白血病在分子生物學(xué)技術(shù)診斷方面的研究進(jìn)行討論。

1.白血病的發(fā)病機制

現(xiàn)代研究顯示，環(huán)境因素和遺傳因素是造成白血病的主要發(fā)病機制。由于電離輻射，化學(xué)致癌物，病毒等環(huán)境因素引起的遺傳物質(zhì)染色體和基因的突變，癌基因點突變激活和腫瘤抑制基因的失活、損耗也是很重要的發(fā)病機制。有些患者可由一些血液疾病發(fā)展為急性白血病。

2.診斷方法

目前，大多數(shù)涉及白血病的相關(guān)基因已被克隆，通過直接或間接檢測這些融合基因可以進(jìn)行白血病的分子診斷。特定染色體異常和基因的突變可作為診斷疾病的發(fā)展和預(yù)后的重要指標(biāo)。目前較為常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)有熒光原位雜交（FISH），實時熒光定量PCR（QR-PCR）、比較基因組雜交（CGH），基因芯片和全基因組測序[3]。

2.1 熒光原位雜交（FISH）

FISH是1980年后發(fā)展起來的一種間接基因定位方法。該法采用標(biāo)記的單鏈DNA探針與其互補的DNA發(fā)生退火、雜交，通過觀察染色體上的熒光信號，來檢測分裂中期或間期細(xì)胞上的核 DNA 位置反映相應(yīng)基因的狀況，可應(yīng)用于臨床各種標(biāo)本的檢測。由于其直觀，快速，靈敏，方便靈活，可量化，在白血病的診斷，治療監(jiān)測，預(yù)后和檢測微小殘留疾病等方面正成為一種不可缺少的重要手段。[4][5]

目前，常用的商品化單序列探針有PML-RARα[t（15；17），見于M3，AML1-ETO[t（8；21），見于M2b]，BCR-ABL[t（9；22），見于CML和ALL]，TEL- AML1[t（12；21），見于兒童前B-ALL]等已經(jīng)應(yīng)用于臨床。臨床常采用多標(biāo)記探針，可以大大提高檢測效率，multicolor-FISH與現(xiàn)代高通量方法對確定新腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域有影響研究。[6]

Soriani S等[7]介紹了微波熒光原位雜交技術(shù)，它是一種新的快速檢測PML-RARα重排的實驗室診斷方法，30 min即可獲得結(jié)果。結(jié)合了細(xì)胞快速收獲，熒光原位雜交和微波束三種技術(shù)，大大提高了檢測效率。

2.2 實時定量PCR（RQ-PCR）

RQ-PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中添加了熒光染料或熒光標(biāo)記探針，然后進(jìn)行PCR過程，檢測體系中熒光強度的變化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的CT值（即在PCR擴增過程中，PCR啟動后熒光信號由本底進(jìn)入指數(shù)生長期的拐點對應(yīng)的周期數(shù)目）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對待檢模板進(jìn)行評估定量分析。RQ-PCR[8]作為新興的精確基因定量技術(shù)，靈敏，特異，技術(shù)成熟，操作簡便，重復(fù)率較高，Dolz S等[9]發(fā)現(xiàn)是AML重組融合基因的靈活和敏感可靠的篩選試驗方法。評估治療反應(yīng)、檢測癌細(xì)胞的數(shù)量，對監(jiān)測MRD具有很大意義[10]。以此作為臨床診斷、評估檢測標(biāo)準(zhǔn)，對患者及早進(jìn)行臨床干預(yù)，從而指導(dǎo)后期治療，進(jìn)而提高長期生存率有重要的臨床價值。

Malik D等[11]報道他們采用RQ-PCR研究兒童急性淋巴白血病時發(fā)現(xiàn)一種新分子miR-2909-KLF4軸，通過它能夠區(qū)分兒童急性B細(xì)胞和T細(xì)胞白血病，這可作為一種新的診斷或預(yù)后評估的標(biāo)記。

Bennour A[12]等通過分析45例陽性慢性粒細(xì)胞白血病，采用多重RT-PCR分析，結(jié)果快速、可靠。

2.3 比較基因組學(xué)

比較基因組雜交（CGH）1992年提出的，是用于檢測整個腫瘤基因組DNA增加或減少的有力的工具。雖然CGH分析不能提供有關(guān)染色體變異的精確信息，但它不需要腫瘤組織培養(yǎng)或核型分析。

曹琪等[13]研究表明CGH是一種快速、簡單和有效的方法，可用于檢測ALL中大片段染色體區(qū)域或染色體數(shù)目的改變。特別適用于染色體培養(yǎng)失敗及形態(tài)差的情況。然而，CGH的應(yīng)用范圍有其局限性，只有與常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析、FISH和其它分子生物學(xué)工具相結(jié)合，才可以全面地闡明基因組的異常。

李莉[14]研究的微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，array CGH）是一種高分辨率、高通量、高效率的全基因組篩查技術(shù)，可以檢測到亞顯微染色體的異常、精確定位，有效地彌補了現(xiàn)有方法的局限性，在非平衡染色體畸變方面作用顯著。

2.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)[15]是一高通量的基因檢測技術(shù)，具有高靈敏度和精確定量檢測的優(yōu)勢，有很好的應(yīng)用前景，近幾年得到越來越多的研究。在白血病基因檢測中，有利于白血病融合基因的發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測微小殘留病的監(jiān)測，追蹤同一患者中多個融合基因、治療中融合基因變異等情況。基因芯片是新一代分子診斷試劑的主要發(fā)展方向。目前，基因芯片技術(shù)大規(guī)模的臨床應(yīng)用還存在著缺陷，基因芯片臨床診斷還未實現(xiàn)，尚處于探索研究階段?，F(xiàn)存在于市面上的主要是低靈敏度和較差特異性的診斷芯片。由于基因芯片技術(shù)上仍需攻關(guān)和輔助診斷設(shè)備昂貴等原因，預(yù)計定量PCR技術(shù)在未來一段時間內(nèi)仍占主導(dǎo)地位。

3.結(jié)束語

分子生物學(xué)技術(shù)具有高效，靈敏，特異性好的優(yōu)勢。不同的診斷方式有不同的優(yōu)缺點，綜合運用對于復(fù)雜或特殊白血病的診斷具有很好的效果。[16][17]

在人類基因組計劃的基礎(chǔ)上，隨著對白血病研究的逐步深入，白血病的異質(zhì)性融合基因和特異性片段越來越多的被發(fā)現(xiàn)，遺傳信息的深入和高通量的診斷技術(shù)的發(fā)展會導(dǎo)致越來越多的分子靶標(biāo)將被應(yīng)用于血液疾病的預(yù)防，預(yù)測，診斷，治療和評估。近年來的熱門研究miRNA與腫瘤的相關(guān)性也在血液腫瘤學(xué)方面有了重要發(fā)現(xiàn)。Ahmad N 等[18]發(fā)現(xiàn)miRNA的失調(diào)與腫瘤的起始事件的推動密切相關(guān)，可作為多發(fā)性骨髓瘤（MM）轉(zhuǎn)移和耐藥性評估的重要指標(biāo)。

分子生物學(xué)技術(shù)檢測的標(biāo)準(zhǔn)化是影響該技術(shù)診斷效果的重要因素，制定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的臨界值，選擇特異、靈敏、標(biāo)準(zhǔn)化的分子標(biāo)記[19]都將是影響分子生物學(xué)技術(shù)在白血病診斷中的關(guān)鍵。

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