經外周靜脈移植臍帶間充質干細胞治療乙型肝炎肝硬化的效果觀察

張 歲，賈 蓓，郭翠敏，王海舫，周 靖

(河北醫科大學第一醫院中西醫結合肝病診療中心，河北 石家莊 050031)

·論 著·

經外周靜脈移植臍帶間充質干細胞治療乙型肝炎肝硬化的效果觀察

張 歲，賈 蓓，郭翠敏，王海舫，周 靖*

(河北醫科大學第一醫院中西醫結合肝病診療中心，河北 石家莊 050031)

目的評價經外周靜脈移植臍帶間充質干細胞治療乙型肝炎肝硬化的臨床效果。方法選擇乙型肝炎肝硬化患者60例，分為治療組和對照組各30例，治療組在內科綜合治療的基礎上給予臍帶間充質干細胞移植治療，對照組給予內科綜合治療。觀察2組治療后2、4、12、24周生化指標變化情況、臨床癥狀改善情況及不良反應發生情況。結果治療4周后，治療組乏力、腹脹、食欲、腹腔積液改善率均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。2組隨治療時間延長丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、總膽紅素均呈下降趨勢，時點間差異有統計學意義(P<0.05)，組間、組間·時點間交互作用差異無統計學意義(P>0.05)；白蛋白、膽堿酯酶、凝血酶原活動度均呈升高趨勢，時點間、組間·時點間交互作用差異有統計學意義(P<0.05)，組間差異無統計學意義(P>0.05)。2組均未發生不良反應和并發癥。結論經外周靜脈移植臍帶間充質干細胞治療乙型肝炎肝硬化安全有效。

肝硬化；乙型肝炎；間質干細胞移植

肝硬化是以肝組織彌漫性肝纖維化、假小葉和再生結節為組織學特征的進行性慢性肝病，是眾多肝病的終末期階段。每年新增肝硬化患者30萬左右[1]，死于肝硬化及其并發癥者近50萬[2]。由乙型肝炎病毒導致的肝硬化占肝硬化患者總數的80%左右[3]。目前治療終末期或失代償期肝硬化最有效的方法為肝移植，但肝移植也伴隨著諸多問題，如肝源缺乏、長期服用免疫抑制劑、手術費用昂貴等，限制了其臨床廣泛應用。干細胞移植技術的發展為肝硬化的治療提供了一條新途徑。臍帶間充質干細胞來源豐富，取材方便，無倫理問題，且細胞含量高、增殖能力強、免疫原性低，越來越受到研究者的關注[4]，被廣泛應用于肝臟疾病的臨床研究，并取得了一定的療效[5-7]。本研究采用經外周靜脈移植臍帶間充質干細胞方法治療乙型肝炎肝硬化患者，并對其安全性及臨床療效進行評估，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年9月—2015年9月我院診治的乙型肝炎肝硬化患者60例，均符合2000年《病毒性肝炎防治方法》中肝硬化的臨床診斷標準。排除標準：確診肝臟或其他臟器腫瘤；重型肝炎急性期；嚴重感染；消化道大出血；肝腎綜合征；Ⅲ期以上肝性腦病；嚴重腦、心、肺疾病以及衰竭狀態患者；有精神疾病者；高度過敏體質者。采用單盲、平行對照分為治療組和對照組。治療組30例，男性17例，女性13例，年齡33～72歲，平均(55.97±9.08)歲；Child-Pugh分級：A級7例，B級12例，C級11例；乙型肝炎病毒DNA<102U/mL 12例，102～104U/mL 8例，>104U/mL 10例；腹腔積液22例。對照組30例，男性18例，女性12例，年齡33～71歲，平均(55.53±9.27)歲；Child-Pugh分級：A級6例，B級14例，C級10例；乙型肝炎病毒DNA<102U/mL 13例，102～104U/mL 6例，>104U/mL 11例；腹腔積液23例。2組性別、年齡、Child-Pugh分級、病毒復制、腹腔積液情況差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經醫院倫理委員會許可，所有患者均簽署知情同意書。

所有患者均給予口服核苷類藥物抗病毒、保肝降酶等內科綜合治療。治療組在此基礎上給予臍帶間充質干細胞輸注治療。

1.2 臍帶間充質干細胞制備 選擇健康產婦，排除艾滋病、梅毒、乙型肝炎、丙型肝炎及其他傳染性疾病，無病理妊娠者，并獲產婦同意并簽署知情同意書。臍帶自手術臺取下后，浸入含抗生素的0.9%氯化鈉注射液中，4 ℃保存，在超凈臺取出臍帶，用PBS沖洗干凈臍靜脈和臍動脈內的殘余血液，用剪刀和止血鉗清除上述血管，將臍帶剪成1 mm3大小的組織塊，通過100 目篩網過濾并收集細胞。置于37 ℃，5% CO2培養箱進行培養。3 d后更換培養液，棄去雜質和未貼壁的細胞，第6～7天后顯微鏡下可見貼壁生長的單個梭形細胞從組織塊中游離出來，再次更換培養液。待細胞長到80%融合時，用0.25%胰蛋白酶進行消化；將細胞懸液1 500 r/min離心5 min，原代細胞以1∶1的比例進行傳代，記為P1代。直至細胞彼此融合，鋪滿瓶底再重復上述操作。P2代以后按1∶3或1∶4的比例傳代。臍帶間充質干細胞傳代到第3代，鏡下觀察，可見細胞貼壁良好，融合密度達85%。進行流式染色后，流式細胞儀上機檢測細胞表型確定為臍帶間充質干細胞。收集培養至第4代的細胞。

1.3 細胞回輸 經外周靜脈回輸臍帶間充質干細胞，輸注前20 min給予肌肉注射苯海拉明注射液20 mg，輸注前后給予生理鹽水100 mL沖管。每次回輸的臍帶間充質干細胞數量為(2～4)×107/mL，用生理鹽水稀釋至100 mL，靜脈滴注。每半月輸注1次，共2次。

1.4 療效評估 治療前及治療后2、4、12、24周檢測患者丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、白蛋白(albumin,ALB)、膽堿酯酶(cholinesterase,CHE)、凝血酶原活動度(prothrombin activity,PTA)水平，觀察臨床癥狀乏力、腹脹、食欲的改善情況，腹部超聲了解腹腔積液情況，觀察治療后不良反應、病死率及肝癌發生率。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析。計量資料比較采用重復測量的方差分析；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床癥狀改善情況 治療4周后，治療組乏力、腹脹、食欲、腹腔積液改善率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 生化指標改善情況 2組隨治療時間延長ALT、AST、TBIL均呈下降趨勢，時點間差異有統計學意義(P<0.05)，組間、組間·時點間交互作用差異無統計學意義(P>0.05)；ALB、CHE、PTA均呈升高趨勢，時點間、組間·時點間交互作用差異有統計學意義(P<0.05)，組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 不良反應 隨訪24周2組均未發生不良反應和并發癥，無肝癌發生，無死亡患者。

表1 2組臨床癥狀改善情況比較

表2 2組生化指標變化

組別 ALT(U/L)治療前治療2周治療4周治療12周治療24周治療組 42.35±21.3041.94±18.1439.94±16.7438.16±16.0535.68±11.68對照組 41.23±23.8338.36±21.6437.25±15.8334.83±17.0434.48±13.38組間 F=0.347 P=0.558時點間 F=4.655 P=0.006組間·時點間F=0.215 P=0.858組別 AST(U/L)治療前治療2周治療4周治療12周治療24周治療組 53.05±27.4949.84±20.4249.68±20.1744.30±16.7442.35±15.22對照組 54.12±31.1151.07±26.4648.95±22.2345.02±18.0343.88±16.12組間 F=0.024 P=0.878時點間 F=7.591 P=0.001組間·時點間F=0.080 P=0.924組別 TBIL(umol/L)治療前治療2周治療4周治療12周治療24周治療組 44.76±18.6243.14±19.2842.69±17.3740.66±19.5637.44±14.82對照組 43.27±18.2339.54±17.5839.30±18.6839.13±19.0635.91±13.33組間 F=0.301 P=0.585時點間 F=6.749 P=0.000組間·時點間F=0.281 P=0.864組別 ALB(g/L)治療前治療2周治療4周治療12周治療24周治療組 30.78±5.5931.37±4.2932.31±4.6333.65±5.1235.05±5.93對照組 31.45±6.0532.01±6.7332.16±5.7031.06±4.7131.83±5.94組間 F=0.490 P=0.487時點間 F=6.992 P=0.011組間·時點間F=8.247 P=0.006組別 CHE(U/L)治療前治療2周治療4周治療12周治療24周治療組 2940.53±1275.502977.83±1302.453215.13±1267.853547.13±1374.223840.63±1403.62對照組 3001.87±1321.032988.97±1295.892873.93±1117.752895.07±1064.693107.87±1210.16組間 F=1.144 P=0.289時點間 F=12.575 P=0.000組間·時點間F=9.332 P=0.000

表2 (續)

3 討 論

肝硬化是嚴重威脅人類健康的肝臟疾病，常并發上消化道出血、肝性腦病、繼發感染等而死亡，內科治療手段有限。臍帶間充質干細胞起源于中胚層，可以分化為中胚層的間質組織，具備干細胞的2個重要特征，即自我更新和多向分化潛能，具有減輕和消除炎癥、修復組織損傷、免疫調節和改善造血等生物學功能，已越來越多地應用于器官損傷的治療，為肝硬化的治療提供了一種新方法。Yang等[8]給肝硬化小鼠通過尾靜脈注入臍帶間充質干細胞，結果顯示血清ALT水平顯著降低，血清ALB水平顯著升高，表明臍帶間充質干細胞移植可以改善小鼠的肝功能，還發現間充質干細胞發揮治療作用的機制為可以分化為肝細胞樣細胞。Hong等[9]通過動物實驗證實給肝硬化小鼠注入臍帶間充質干細胞可以通過分解膠原纖維改善肝硬化的程度。本研究通過外周靜脈途徑移植臍帶間充質干細胞治療乙型肝炎肝硬化患者，并對其安全性和臨床療效進行分析。

本研究結果發現，2組治療隨時間延長ALB、CHE、PTA水平呈升高趨勢，ALB、CHE、PTA均為肝臟合成功能的指標，提示臍帶間充質干細胞可以改善肝硬化患者的合成功能，其可能機制為：①干細胞“歸巢”到達受損傷的肝臟后可以分化為功能性肝細胞，抑制肝細胞的凋亡，分泌多種生物活性因子促進肝細胞的再生[10-12]；②肝纖維化是所有慢性肝病的共同病理基礎，干細胞抑制肝纖維化[13-17]可能為其改善肝功能的機制之一；③氧化應激反應誘發肝損傷，干細胞的抗氧化活性起到了降低肝損傷的作用[18]；④炎癥細胞浸潤和免疫損傷在肝硬化的發生發展過程中起了重要推動作用，研究證明干細胞可表達各種可溶性因子，如前列腺素E2、吲哚胺2,3雙加氧酶、白細胞介素6、白細胞介素10和人白細胞抗原G，這些可溶性因子可調節各種免疫細胞的增殖和功能[19]，另外干細胞可以減少CD4+T細胞的浸潤和激活，抑制Th1輔助細胞，誘導調節性T細胞，并可調控樹突細胞，樹突細胞通過表皮生長因子β的產生誘導調節性T細胞分化[20]。本研究結果還顯示，2組隨治療時間延長ALT、AST、TBIL均呈下降趨勢，但2組的改善趨勢無差異，考慮2組ALT、AST、TBIL治療后較治療前降低與保肝降酶效果顯著有關，影響了臍帶間充質干細胞對上述指標的改善效果。

本研究結果顯示，治療組臨床癥狀明顯改善，未發生與干細胞移植相關的不良反應，安全性好。既往有研究指出干細胞可通過直接轉化、抑制抗腫瘤免疫反應和對腫瘤細胞的營養作用等導致腫瘤發生[21]。但也有報道認為干細胞移植可能對肝硬化患者發揮了更好的保護作用，防止了肝癌發生[22]。本研究2組乙型肝炎肝硬化患者隨訪24周均無肝癌發生，進一步說明了臍帶間充質干細胞治療的安全性。

綜上所述，經外周靜脈移植臍帶間充質干細胞治療乙型肝炎肝硬化患者，可以改善其肝功能和臨床癥狀，無嚴重不良反應發生，安全有效，與既往報道的臍帶間充質干細胞移植可以改善患者肝功能的結果相似[5-7]。但本研究病例數量少，隨訪時間短，仍需設計大樣本對照試驗進行長期隨訪觀察。

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(本文編輯：趙麗潔)

Therapeutic effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation via peripheral vein in the treatment of hepatitis B liver cirrhosis

ZHANG Sui， JIA Bei， GUO Cui-min, WANG Hai-fang, ZHOU Jing*

(DepartmentofLiveDiseaseDiagnosesandTreatmentCenterofChineseWesternMedicine,theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China)

Objective To evaluate the curative effect of peripheral vein transplant human umbilical cord mesenchymal stem cells on patients with hepatitis B liver cirrhosis. Methods Sixty patients with hepatitis B liver cirrhosis were equally divided into treatment group and control group. The treatment group was given umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation on the basis of comprehensive medical treatment and the control group was adapted with the comprehensive medical treatment. The changes of biochemical indexes, clinical symptoms and the occurrence of adverse reactions at 2, 4, 12 and 24 weeks before and after treatment were observed. Results After 4-week treatment, the improvement rate of fatigue, abdominal distension, appetite and ascites in the treatment group were higher than that in the control group and the differences have statistical significance(P<0.05). With time extension, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and total bilirubin of the two groups were decreased, there was significant difference of time dissimilarity between two groups(P<0.05), but there were no significant differences of interblock and interaction of interblock with time dissimilarity between two groups(P>0.05). The albumin, cholinesterase and prothrombin activity showed an increasing trend and there were significant differences of time dissimilarity and interaction of interblock with time dissimilarity between two groups(P<0.05), but there was no significant difference of interblock between two groups(P>0.05). There were no suffered severe complications and adverse reactions in all groups. Conclusion Human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation via peripheral vein in the treatment of hepatitis B liver cirrhosis is safe and effective.

liver cirrhosis；hepatitis B；mesenchymal stem cell transplantation

2016-11-24；

2017-01-03

河北省醫學科學研究重點課題(20150636)

張歲(1982-)，女，河北辛集人，河北醫科大學第一

R575.2

A

1007-3205(2017)03-0270-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.006

醫院主治醫師，醫學碩士，從事肝臟疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:zj21362165@126.com