高效液相色譜法測定前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量

田玉路，王宏俠，高 萌，趙麗麗，張蘭桐，王 巧

(河北醫科大學藥學院藥物分析教研室，河北 石家莊 050017)

·論 著·

高效液相色譜法測定前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量

田玉路，王宏俠，高 萌，趙麗麗，張蘭桐，王 巧*

(河北醫科大學藥學院藥物分析教研室，河北 石家莊 050017)

目的對前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素常用的高效液相色譜法含量測定方法進行改進，用于市售前胡的分析。方法改用甲醇作為提取溶劑，超聲處理時間為30 min，提取液直接測定分析。采用Thermo ODS HYPERSIL色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，以甲醇-水(68∶32)為流動相。結果白花前胡甲素和白花前胡乙素分別在5.00～400.00 mg/L和0.50～40.00 mg/L范圍內線性關系良好，回歸方程分別為Y=28.478 222 4X+6.484 094(r=0.999 99)和Y=25.589 318 7X-0.328 822(r=0.999 99)，精密度為0.6%～2.0%，加樣回收率為90.7%～104.8%。采用建立的方法對9批市售前胡進行了測定。結論該方法更簡便、快速、重復性好，可準確測定前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素。

前胡；白花前胡甲素；白花前胡乙素；高效液相色譜法

前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根，具有降氣化痰、散風清熱的功效，主要用于治療痰熱喘滿、咯痰黃稠、風熱咳嗽痰多等癥[1]，其主要化學成分為香豆素類化合物[2-4]，文獻報道香豆素類化合物具有多方面的藥理作用[5-16]。目前常通過高效液相色譜法檢測[1，17-19]，采用白花前胡甲素和白花前胡乙素作為定量指標控制前胡的質量。這些方法制備供試品溶液時常采用三氯甲烷作為提取溶劑，溶劑毒性較大，并且有溶劑揮干過程，操作較繁瑣，條件不易控制。為此，本研究對白花前胡甲素和白花前胡乙素的高效液相色譜法含量方法進行改進，以期為前胡質量控制提供一簡單、重現性好、環境又好的測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 1200系列高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，包括四元泵(G1311A)，自動進樣器(G1329A)，VWD檢測器(G1314B)，DAD檢測器(G1315D)，在線脫氣機(G1322A)以及柱溫箱(G1316A)；KQ5200E型超聲波清洗器(功率200 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；FW80型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；PW系列超純水系統(力康生物醫療科技控股有限公司)。

1.2 試藥 白花前胡甲素(批號：111711-200602)和白花前胡乙素(批號：111904-201203)對照品均購自于中國食品藥品檢定研究院。水為超純水，甲醇為色譜純(美國天地有限公司)和分析純(天津市永大化學試劑有限公司)。9批前胡分別收集于不同地區，并經河北省食品藥品檢驗研究院段吉平主任藥師進行生藥學鑒定。各樣品均由FW80型高速萬能粉碎機粉碎，粉末過3號篩保存于干燥器內備用。

1.3 色譜條件 Thermo ODS HYPERSIL色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(68∶32)；流速0.8 mL/min；檢測波長322 nm；柱溫30 ℃，進樣體積10 μL。對照品溶液和供試品溶液的高效液相色譜法色譜圖見圖1。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品溶液的制備 取白花前胡甲素和白花前胡乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含白花前胡甲素400 mg/L和白花前胡乙素40 mg/L的混合對照品溶液，過微孔濾膜(0.45 μm)，即得。

1.4.2 供試品溶液的制備 取前胡粉末約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過微孔濾膜(0.45 μm)，即得供試品溶液。

圖1 對照品和樣品高效液相色譜法色譜圖

A.對照品；B.樣品；1.白花前胡甲素；2.白花前胡乙素

Figure 1 The high performance liquid chromatography chromatograms of standard and sample solution

1.5 方法學驗證

1.5.1 重復性試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，重復進樣5次，計算白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)值，考察儀器重復性。

1.5.2 標準曲線及線性范圍 將混合對照品溶液依次用甲醇稀釋，得到分別含白花前胡甲素400、200、100、50、10、5 mg/L；白花前胡乙素40、20、10、5、1、0.5 mg/L的系列混合對照品溶液，過微孔濾膜(0.45 μm)，即得標準曲線溶液。分別精密吸取各標準曲線溶液10 μL進樣分析，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標用加權最小二乘法(W=1/X)進行一元線性回歸，繪制標準曲線。標準曲線的準確度按如下公式計算：相對誤差(relative error，RE)(%)=(回歸濃度-實際濃度)/實際濃度×100%。

1.5.3 檢測限與定量限 將混合對照品溶液逐步稀釋并進行測定，以信噪比(signal-noise ratio，S/N)=3和S/N=10時分析物的濃度為檢測限和定量限。

1.5.4 精密度試驗 按供試品溶液的制備方法，平行制備6份，連續重復3 d，測定含量，計算日內精密度RSD值和日間精密度RSD值，考察方法的精密度。

1.5.5 回收率試驗 取前胡粉末，精密稱定9份(各0.050 g)，分別精密加入同一濃度混合對照品溶液2.5、5.0、7.5 mL，各平行3份，精密加入甲醇補足至10 mL，按供試品溶液的制備方法，制備溶液，測定分析物的含量并計算回收率。加樣回收率按如下公式計算：(測得量-藥材中量)/加入量×100%。

1.5.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于室溫放置0、12、24 h時進樣分析，測定分析物的濃度，考察方法的穩定性。

1.5.7 樣品測定 分別取各前胡樣品制備供試品溶液，并注入液相色譜儀測定白花前胡甲素和白花前胡乙素的峰面積，按標準曲線法計算含量。

2 結 果

2.1 方法學驗證 重復性測定結果白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面積的RSD分別為0.4%和0.5%，表明該儀器重復性良好。回歸方程為：白花前胡甲素Y=28.478 222 4X+6.484 094(r=0.999 99)線性范圍5.00～400.00 mg/L；白花前胡乙素Y=25.589 318 7X-0.328 822(r=0.999 99)，線性范圍0.50～40.00 mg/L。白花前胡甲素和白花前胡乙素各濃度點的RE值為-0.8%～1.0%。白花前胡甲素和白花前胡乙素的檢測限分別為0.039 7 mg/L和0.103 7 mg/L，定量限分別為0.198 5 mg/L和0.518 4 mg/L。白花前胡甲素的日內與日間精密度分別為0.9%和2.0%；白花前胡乙素的日內與日間精密度分別為0.6%和1.4%。加樣回收率為90.7%～104.8%，回收率試驗結果見表1，2。穩定性結果白花前胡甲素和白花前胡乙素在3個時間點濃度差異的RSD均<2.0%，表明該法穩定性良好。

2.2 樣品測定 白花前胡甲素的含量為0.73%～2.24%，白花前胡乙素的含量為0.12%～0.33%，見表3。

表1 白花前胡甲素回收率試驗結果

表2 白花前胡乙素回收率試驗結果

表3 前胡樣品中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量測定結果

3 討 論

3.1 提取方法 《中國藥典》(2015年版)與文獻報道[17-18]常采用三氯甲烷作為提取溶劑進行實驗，為了避免提取溶劑三氯甲烷對色譜系統的影響，在制備供試品溶液時需要先將三氯甲烷除去，因此常涉及溶液的揮干、轉移操作，致使方法繁瑣。另外，因方法中有濾過操作，由于三氯甲烷的強揮發性，往往使過濾前后溶液濃度易發生改變，條件不易控制，且三氯甲烷具有較明顯的毒性。

針對以上問題，本研究嘗試通過改變提取溶劑進行方法改進。依照方法，比較了常用提取溶劑氯仿、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、乙醚和丙酮對2種成分的提取效果，結果發現，氯仿和乙醚分別對白花前胡甲素和白花前胡乙素具有最高的提取效率，甲醇對白花前胡甲素的提取僅次于氯仿，無水乙醇、乙酸乙酯、乙醚和丙酮對白花前胡甲素均不能有效提取，甲醇和乙醚對白花前胡乙素的提取效率相近。因此本研究選擇甲醇替代氯仿作為提取溶劑，既避免了溶劑的強揮發性對測定結果的影響，也因為甲醇與反相色譜適用而省去揮干溶劑的過程。

為了達到最佳提取效率，考察了不同超聲時間(10、20、30、40、50 min)，結果顯示，超聲30 min時白花前胡甲素和白花前胡乙素的提取效率最高。為了考察是否提取完全，將提取后殘渣用甲醇洗凈，再進行第2次提取，經檢測發現，第2次提取液中白花前胡甲素峰面積占第1次提取液中峰面積的0.045 4%，且未檢測到白花前胡乙素峰，故可認為甲醇超聲提取30 min可達到完全提取。

3.2 色譜條件 本研究初期嘗試了DIKMA Diamonsil C18(2)(4.6×250 mm，5 μm)、Purospher STARLP RP-18 endcapped(4.6×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)和Thermo ODS HYPERSIL(4.6×250 mm，5 μm) 4種色譜柱進行測定，結果發現，相對于白花前胡甲素，白花前胡乙素易受到其他色譜峰的干擾，僅在一種色譜柱上達到良好分離效果，在其他色譜柱上不僅無法分離，且易與相鄰峰合并為一個色譜峰，即使改變流動相比例也無法改善。如此，其他色譜峰產生的峰面積也易按白花前胡乙素計，致使白花前胡乙素測定結果偏高，產生較大誤差。根據以上結果可以看出，白花前胡甲素和白花前胡乙素2種成分的測定對色譜柱的要求較嚴格，尤其是后者，因此，對2種成分測定時應選擇合適的色譜柱，并注意峰分離情況。

3.3 改進方法與藥典方法比較 本研究以《中國藥典》(2015年版)中記載的方法為例，與改進方法的含量測定結果進行比較?？梢钥闯鲇?批樣品的含量測定結果改進方法略高于藥典方法，說明本研究方法顯示出較高的提取效率。改進方法操作簡單、結果準確，且首次注意到白花前胡乙素在色譜分離時出現的峰包合現象，可用于前胡的質量控制。

3.4 市售前胡樣品質量分析 《中國藥典》(2015年版)規定前胡樣品按干燥品計算，含白花前胡甲素不得少于0.90%，含白花前胡乙素不得少于0.24%。改進方法樣品測定結果可知，采集的9批樣品中僅有一批樣品(樣品1)2種成分含量都合格，白花前胡甲素合格或白花前胡乙素合格的各有4批樣品。若按《中國藥典》(2015年版)中規定的含量測定方法測定，同樣是不合格的結果。以上結果初步說明，市售前胡樣品合格率極低，且各批次間的含量測定結果偏差較大，提示前胡質量和市場亟待有效控制和管理。

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(本文編輯：趙麗潔)

Determination of contents of praeruptorin A and praeruptorin B in Peucedani Radix by high performance liquid chromatography

TIAN Yu-lu, WANG Hong-xia, GAO Meng, ZHAO Li-li, ZHANG Lan-tong, WANG Qiao*

(DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,theSchoolofPharmacy，HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To improve the method for the determination of praeruptorin A and praeruptorin B in Peucedani Radix by high performance liquid chromatography. Then the method was used for the analysis of commercial “Qian Hu”. Methods Methanol was used as the extraction solvent and ultrasonic extraction time was 30 min. The extract was analyzed directly. The separation was performed on a Thermo ODS HYPERSIL(4.6×250 mm, 5 μm) column using methanol and water(68∶32) as mobile phase. Results The methodology validation presented that praeruptorin A and praeruptorin B were in good correlation in the range of 5.00-400.00 mg/L and 0.50-40.00 mg/L with the regression equations of Y=28.478 222 4X+6.484 094(r=0.999 99) and Y=25.589 318 7X-0.328 822(r=0.999 99), respectively. The results of the precision (RSD) and recoveries were in the range of 0.6%-2.0% and 90.7%-104.8%, respectively. Nine batches of commercial “Qian Hu” were determined by the established method. Conclusion The method is simpler, more rapid and more reproducible. It can be used for the accurate determination of praeruptorin A and praeruptorin B in Peucedani Radix.

Peucedani Radix; praeruptorin A; praeruptorin B; high performance liquid chromatography

2016-03-11；

2016-04-08

田玉路(1989-)，女，河北曲陽人，河北醫科大學藥學院理學碩士研究生，從事藥物質量控制研究。

*通訊作者。E-mail：qiaowang88@hotmail.com

R917

A

1007-3205(2017)03-0331-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.020