非小細胞肺癌胸水細胞塊KRAS基因突變檢測分析

徐建平 朱禮陽 于忠和 趙潔婷 葉偉 朱東波 孫曉 宋蓉蓉 許春偉 譚琪凡

·論 著·

非小細胞肺癌胸水細胞塊KRAS基因突變檢測分析

徐建平1朱禮陽2于忠和2趙潔婷1葉偉1朱東波1孫曉1宋蓉蓉1許春偉3譚琪凡2

目的 探討非小細胞肺癌胸水細胞塊在鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS)突變檢測中的臨床價值。方法 采用ARMS-PCR法檢測215例非小細胞肺癌細胞塊和404例非小細胞肺癌組織塊中KRAS的7種突變類型，并檢測細胞塊同時送檢組織塊74例患者的一致性。 結果 細胞塊KRAS基因突變型24例，陽性率11.16%(24/215)；組織塊KRAS基因突變型37例，陽性率9.16%(37/404)；74例有組織塊對照的細胞塊KRAS結果一致性有69例，一致率達93.24%%(69/74)，其中細胞塊KRAS基因的突變率10.81%(8/74)，組織塊突變率17.57%(13/74)。結論 非小細胞肺癌胸水細胞塊KRAS的突變率略高于組織塊；有胸水的原發灶比沒有胸水的KRAS基因突變率要高。

肺腫瘤；非小細胞肺癌；細胞塊；KRAS

肺癌是目前惡性腫瘤死亡的首要原因，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌病例的80%[1-4]。非小細胞肺癌中存在眾多驅動基因，其中KRAS基因是非小細胞肺癌的驅動基因之一，KRAS基因突變是EGFR-TKIs靶向治療導致耐藥的原因之一。KRAS基因是EGFR信號傳導通路中重要的下游分子，非小細胞肺癌突變率約為5%-30%[5-8]。KRAS基因突變大多發生在12、13和61位密碼子，而非小細胞肺癌中近97%KRAS基因突變涉及12或13位密碼子[9]。目前，非小細胞肺癌的靶向治療已經進入規范化階段。隨著靶向藥物的不斷更新，KRAS基因檢測是EGFR TKIs用藥前檢測基因之一。檢測樣本類型均在組織塊、細胞涂片、細胞蠟塊和血液樣本得到驗證。目前，脫落細胞制成細胞塊的KRAS基因突變檢測的報道較少，本文著重探討非小細胞肺癌胸水細胞塊檢測KRAS基因突變的臨床價值。

資料與方法

一、材料

1 標本：收集安徽省胸科醫院病理科2012年1月-2016年8月診斷為非小細胞肺癌的細胞塊215例和組織標本404例。細胞塊標本來源于胸水，組織塊標本來源于胸膜、肺穿和手術標本。

2 細胞塊的制備：將新鮮胸水混勻后收集50mL于離心管內，2000r/min離心5min，棄上清液，如沉淀量不夠，可反復離心收集(血性標本先加入3%醋酸乙醇10mL，振蕩均勻，2000r/min 5min，去除血細胞干擾)；向沉淀中加10%中性福爾馬林5mL，振蕩，2000r/min離心5min，棄上清液；向沉淀中加95%乙醇10mL，振蕩混勻，2000r/min離心10 min，棄上清液；底部沉淀鑷取到擦鏡紙上，包好，與常規組織一起行脫水處理，制成細胞石蠟塊。

3 實時熒光定量PCR檢測非小細胞肺癌細胞塊和組織中KRAS基因突變：實時熒光定量PCR 對KRAS基因突變進行體外擴增：顯微鏡下確認腫瘤細胞后，取4μm厚度的細胞塊和組織塊切片4-8片，脫蠟；并按照提取基因組RNA 試劑盒(QIAamp RNA FFPE Kit，德國QIAGEN公司)說明書提供的方法提取組織DNA。應用分光光度計檢測所提取DNA的純度和濃度,按照KRAS基因突變定性檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥科技有限公司)說明書提供的方法，在Mx3000P實時熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)中進行擴增。該試劑盒包含KRAS基因突變類型改變(見表1)。

表1 KRAS基因突變類型

4 統計學分析：所有數據采用SPSS19.0統計軟件，結果運用χ2及Fisher確切概率法，檢驗水準α=0.05，并設定P值為雙側分布，且以P<0.05為差異有統計學意義。κ>0.75為一致性極好，0.4≤κ≤0.75為一致性良好，κ<0.4為一致性差。

結 果

一、細胞塊和組織塊KRAS基因突變率

215例細胞塊中，KRAS基因突變型24例，陽性率為11.16%(24/215)，其中女性15例，男性9例。404例組織塊中，KRAS基因突變型37例，陽性率為9.16%(37/404)，其中女性23例，男性14例(見表2)。

二、配對細胞塊和組織塊KRAS基因突變檢測

74例有組織塊對照的細胞塊中，KRAS基因突變型8例，陽性率為10.81%；74例組織塊中，KRAS基因突變型13例，陽性率為17.57%。兩種蠟塊檢測結果一致的有69例，其中兩者共同陽性8例，共同陰性61例，一致率為93.24%%(69/74)；未見細胞塊陽性和組織塊陰性病例，細胞塊陰性、組織塊陽性5例，兩組相比差異有統計學意義(χ2=35.948,P=0.000)，Kappa=0.754(見表3)。

表2 KRAS基因突變檢測結果

表3 有組織塊對照的細胞塊檢測對比結果

討 論

KRAS基因屬于RAS基因家族。RAS基因家族當中，還有NRAS(neurolastoma-RAS)和HRAS(Harvey-RAS)[10]。KRAS基因位于第12號染色體的短臂上，KRAS蛋白有188個氨基酸，分子量為21.6kDa，在正常細胞中，細胞膜上EGFR、HER2、ErbB3、ErbB4等受體單體，在與細胞膜外的配體結合之后，就會變成二聚體。這些二聚體自身磷酸化，再磷酸化下游的信號蛋白。其中一條信號通路就是激活Grb2-Shc，再激活SOS蛋白。SOS蛋白會激活KRAS蛋白。被激活的下游信號蛋白，包括：Raf蛋白家族、PI3K、PLC-ε、RALGDS、TIAM1、RIN1這些下游蛋白。這些下游的信號通路打開之后，會進一步激活再下游的信號通路，進而啟動細胞增殖、細胞遷移等細胞功能。KRAS基因異常主要為點突變和基因擴增，由于第4外顯子的拼接方式不同，更易發生突變[11]。KRAS基因點突變以第2號外顯子11、12、13、59和61密碼子多見，其中96%發生在第2號外顯子12、13密碼子。而KRAS基因突變后導致自身總處于活化狀態，因而不受EGFR上游信號的影響，這種狀態下使用EGFR靶向藥物治療無效[12]。

目前國內外研究報道指出胸水細胞塊是檢測非小細胞肺癌中KRAS基因突變的有效途徑。2012年李梅等[13]研究發現非小細胞肺癌胸水細胞塊KRAS基因突變檢測結果與組織學一致。2014年張士偉等[14]研究表明對失去手術機會而難以獲得組織標本的晚期非小細胞肺癌患者，可應用ADx-ARMS方法選擇胸水細胞塊標本篩查KRAS基因突變。本組結果顯示，細胞塊的非小細胞肺癌患者KRAS基因突變率略高于組織塊，提示具有轉移性的非小細胞肺癌患者有更高的KRAS基因突變率。在既有組織塊對照的細胞塊中， KRAS基因突變型8例，陽性率為10.81%；對應組織塊中，KRAS基因突變型13例，陽性率為17.57%。兩種蠟塊檢測結果一致的有69例，其中兩者共同陽性8例，共同陰性61例，一致率為93.24%%(69/74)；未見細胞塊陽性和組織塊陰性病例，細胞塊陰性、組織塊陽性5例，兩組相比差異有統計學意義(χ2=35.948,P=0.000)，Kappa=0.754。

綜上所述，應用細胞學標本、細胞塊檢測KRAS基因突變，結果確實可信；細胞塊解決了脫落細胞無法保存和連續切片的問題，具有一定臨床應用價值。

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Analysis of cell blocks KRAS mutation in pleural effusion of lung adenocarcinoma

XUJian-ping,ZHULi-yang,YUZhong-he,ZHAOJie-ting,YEWei,ZHUDong-bo,SUNXiao,SONGRong-rong,XUChun-wei,TANQi-fan

DepartmentofPathology,AnhuiChestHospital,Hefei,Anhui230032,China

Objective To investigate the clinical value of cell block for kirsten rat sarcoma viral oncogene (KRAS) mutation detection in non-small cell lung cancer(NSCLC). Methods 215 cases of cell block from pleural effusion of non-small cell lung cancer were collected. 7 types of KRAS mutation and 404 cases of tissue block were detected by ARMS-PCR method. The consistency of KRAS mutation was examined in 74 patients with tissue block and cell block. Results KRAS mutations were found in 24 of 215 cell blocks (positive detection rate of 11.16%). KRAS mutation was detected in 37 of 404 tissue blocks (positive detection rate of 9.16%). There were 69 cases in the 74 (93.24%) cases having the same result as tissue block. KRAS mutation was detected in 8 of 74 (10.81%) cell blocks, and 13 of 74 (17.57%) tissue blocks. Conclusion The rate of KRAS mutation in cell blocks of non-small cell lung cancer is higher than in matched tissue blocks. The patients with malignant pleural effusion are likely tend to KRAS mutation compare to those not.

lung neoplasm; adenocarcinoma; cell block; KRAS

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.04.001

國家自然科學基金(No 81372489)；北京市科技計劃課題(No 2131100006813032)；軍事醫學科學院附屬醫院創新科研基金項目(No ZH-2014-10)

1. 230032 安徽 合肥，安徽省胸科醫院病理科 2. 100700 北京，陸軍總醫院腫瘤科 3. 100071 北京，軍事醫學科學院附屬醫院病理科

于忠和，E-mail: 773080192@qq.com

2016-09-12]