西羅莫司抗紅藻氨酸誘發的未成年C57BL/6小鼠癲癇的有效劑量

吳美玲，楊鑫杰，劉福榮，王昱植，陳丹嬌，吳 赟，朱 鋒，曾玲暉

（浙江大學城市學院醫學院，浙江杭州 310015）

西羅莫司抗紅藻氨酸誘發的未成年C57BL/6小鼠癲癇的有效劑量

吳美玲，楊鑫杰，劉福榮，王昱植，陳丹嬌，吳 赟，朱 鋒，曾玲暉

（浙江大學城市學院醫學院，浙江杭州 310015）

目的探索西羅莫司（Sir）治療未成年小鼠癲癇的安全有效劑量及作用。方法10日齡的C57BL/6小鼠單次ip給予卡莫酸（紅藻氨酸，KA）12.0 mg·kg-1誘導癲癇，于造模后24 h隔天分別ip給予Sir 0.3，1.0和3.0 mg·kg-1直至3 d、7 d、3周、5周和6周，采用Western蛋白印跡法檢測S6蛋白表達及其磷酸化水平，確定最低有效劑量。觀察Sir最低有效劑量對學習記憶和生長發育的影響，其中Doublecortin（DCX）免疫熒光染色檢測海馬神經元發育，Morris水迷宮測定小鼠學習記憶水平，懸尾、O迷宮和新事物認知實驗測定小鼠焦慮抑郁狀態。結果Western蛋白印跡結果顯示，Sir 0.3 mg·kg-1對正常小鼠和KA致癇小鼠S6蛋白磷酸化無顯著影響，而1.0和3.0 mg·kg-1均可顯著抑制KA致癇小鼠S6蛋白磷酸化（P＜0.05）。選取Sir 1.0 mg·kg-1作為最低有效劑量。Sir 1.0 mg·kg-1對DCX表達和體質量無顯著影響。Morris水迷宮結果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠平臺潛伏期和游泳距離明顯延長（P＜0.05），穿越平臺象限次數明顯下降（P＜0.05），而Sir 1.0 mg·kg-1可顯著逆轉KA致癇模型小鼠學習記憶功能下降（P＜0.05），且與正常對照組無顯著差異。KA致癇模型小鼠在懸尾實驗中顯示懸尾不動時間明顯上升（P＜0.05），O迷宮實驗中移動距離、開臂中停留時間以及新事物認知實驗中與新事物的觸碰時間、觸碰頻率、移動距離和速度明顯縮短（P＜0.05），而Sir 1.0 mg·kg-1可顯著逆轉KA致癇模型小鼠的焦慮抑郁狀態（P＜0.05），且與正常對照組無顯著差異。結論Sir 1.0 mg·kg-1對未成年期癲癇小鼠的mTOR信號通路異常激活和癲癇后共病形成有抑制作用，且不良反應輕微，為理想的給藥劑量。

癲癇；西羅莫司；學習認知功能；蛋白表達

癲癇是大腦神經元異常放電，導致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病，也是神經系統的常見病和多發病。據統計，癲癇總體發病率為0.08‰，發達國家為0.5‰，發展中國家是發達國家的2～3倍［1］。癲癇的反復發作影響相應的神經生物學、認知、心理學以及社會學等方面的功能［2］。嬰幼兒期是癲癇發作的高峰期，患病率為1.8‰～3.5‰，在產科重癥監護單元的發生率為1%～2%［3］。導致嬰幼兒期癲癇的病因眾多，主要包括低氧缺血性腦病、急性代謝性疾病、腦血管疾病、神經系統感染和先天性發育異常等［4］。生命早期癲癇發作可能導致慢性癲癇認知障礙和行為變化，如自閉癥［5］。近年來，越來越多的動物研究提示，嬰幼兒期頻繁或較長時間的癲癇發作可因干擾腦的發育進程引起神經網絡結構和功能的異常改變。嬰幼兒時期大腦及身體各器官均未發育成熟，所以相對于成年期癲癇其治療更棘手，療效并不盡如意，且對嬰幼兒神經系統產生抑制作用，造成低血壓、心動過緩、窒息和呼吸抑制，以及停藥后引發撤藥綜合征［6］。因此，探尋新的治療靶點及研發新型藥物將有利于嬰幼兒期癲癇的治療。

哺乳動物西羅莫司靶蛋白〔mammalian target of sirolimus（Rapamycin），mTOR）〕信號通路是調控細胞生長增殖和蛋白質合成的重要信號通路，通過磷酸化作用調控細胞內mRNA的翻譯，參與膜蛋白轉運、蛋白質降解、蛋白激酶C信號轉導和核糖體合成等［7］。核糖體蛋白S6為mTOR信號通路的效應蛋白，經P70S6激酶作用磷酸化，從而調控蛋白質翻譯及細胞生長［8］。前期研究表明，卡莫酸（紅藻氨酸，kainic acid，KA）誘導的癲癇動物模型中，mTOR信號通路的激活以磷酸化S6蛋白水平顯著增加為特征［9-10］。Sir是mTOR的特異性抑制劑，作為抗腫瘤藥和免疫抑制劑已廣泛應用于臨床［11-13］。在神經系統，mTOR信號通路調節神經元發育和突觸可塑性［14］。我們的前期研究發現，在多種癲癇模型中mTOR通路被異常激活［15-19］，給予mTOR抑制劑Sir治療能減少甚至消除自發性癲癇及相應的神經損害［20-21］。mTOR異常激活在嬰幼兒缺血缺氧引起的獲得性癲癇中起重要作用，Sir給藥可降低mTOR信號通路的異常激活［5］。然而，高劑量Sir的長期用藥會導致生長發育遲緩和免疫功能降低等不良反應。為此，本研究在10日齡出生C57BL/6小鼠采用KA誘導癲癇發作，探討降低Sir劑量在未成年小鼠中的作用，從而進一步為Sir臨床應用于嬰幼兒癲癇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

KA購自美國Nanocs公司；Sir購自美國LC實驗中心；S6、p-S6抗體購自美國CST公司；DCX抗體購自美國Santa Cruz生物公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶標記的二抗、吐溫80、PEG400和Triton X-100購自南京碧云天公司；熒光二抗購自美國LI-COR公司；硝酸纖維素膜和ECL化學發光試劑盒購自德國Millipore公司；多聚甲醛、無水乙醇、蔗糖購自上海國藥集團化學試劑有限公司；BSA購自上海澤衡生物技術有限公司。

1.2 動物造模和用藥方法

出生后10 d齡的C57BL/6小鼠用于本實驗，一共180只，由上海斯萊克實驗動物中心提供，實驗動物許可證：SCXK 2007-0005。動物實驗遵守浙江大學醫學院動物實驗管理規范。動物的飼養條件為溫度（24±1）℃，濕度40%～60%，晝/夜各12 h。KA用生理鹽水溶解成5.0 g·L-1后，以12.0 mg·kg-1的劑量單次ip給予誘導C57BL/6小鼠急性癲癇發作。癲癇的分級參照1972年Raccine制定的標準[22]，急性癇性發作大于三級的動物用于下一步實驗。癲癇分級標準：一級，靜止不動伴隨口/面部運動；二級，點頭及落水狗樣抖動；三級，前肢痙攣；四級：豎立和（或）全身僵直；五級，豎立并跌倒。Sir用乙醇溶解成30 g·L-1貯存于-20°C，臨用前用含5%吐溫80、5%PEG400和4%乙醇的溶劑新鮮配制。

小鼠隨機分為正常對照組、模型組和給藥組，正常對照組注射生理鹽水，模型組注射KA 12.0 mg·kg-1，給藥組給予KA 12.0 mg·kg-1和Sir，Sir于KA誘發癲癇后24 h隔天給藥1次直至3 d、7d、3周、5周和6周。在探究不同劑量Sir對海馬及皮質S6蛋白活性影響實驗中，Sir分為0.3，1.0和3.0 mg·kg-1組。在用Western蛋白印跡實驗確定Sir 1.0 mg·kg-1為有效劑量后，后續實驗Sir劑量為1.0 mg·kg-1。

1.3 Western蛋白印跡法檢測海馬和皮質S6蛋白的表達及磷酸化水平

小鼠在KA致癇后3 d、1周、3周和5周斷頭取腦，分離海馬及相應大小的皮質組織，經超聲裂解組織后離心取上清測定蛋白濃度。蛋白經SDSPAGE電泳分離和轉膜，在脫脂牛奶中室溫封閉1 h，分別加入p-S6和S6抗體孵育，采用ECL化學發光法獲取蛋白表達信號，并采用ImageJ軟件分析其積分吸光度，計算p-S6/S6的比值。

1.4 Doublecortin（DCX）免疫熒光染色檢測海馬神經元發育

小鼠經5%水合氯醛深度麻醉后暴露心臟，迅速將注射器針插入小鼠左心室，并剪開右心耳，灌以生理鹽水，繼以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液快速灌注，迅速開顱取全腦，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液繼續固定24 h，依次經15%、30%蔗糖溶液脫水包埋，經冠狀切面冰凍切片，片厚20 μm，貼附于涂有鉻釩明膠的載玻片上，每隔100 μm取一片。切片用PBS沖洗后，在含有0.1%Triton X-100和5%小牛血清蛋白的TBS緩沖液中室溫孵育30 min。后與DCX特異性一抗于4℃孵育過夜，次日與相應熒光標記的二抗反應，結果在激光共聚焦顯微鏡下觀察。選定固定區域進行計數，計算單位面積內各組DCX陽性細胞數量。

1.5 Morris水迷宮實驗檢測平臺潛伏期、游泳距離、游泳速度和平臺穿過次數

造模后給藥4周開始進行水迷宮實驗。水迷宮實驗前需對小鼠進行連續4 d的訓練，每天訓練4次，每次間隔1 h。實驗前，先將小鼠置于平臺上10 s，讓其觀察周圍環境，隨后將小鼠分別從4個象限隨機放入水迷宮中。攝像頭記錄小鼠運動軌跡，當小鼠到達平臺后10 s停止記錄。如小鼠在60 s內未找到平臺，則引導其到平臺上并停留10 s。訓練4 d后，將小鼠從平臺對面象限放入水迷宮中，小鼠的平臺潛伏期（小鼠到達平臺的時間）、游泳距離、游泳速度以及撤掉平臺后穿過平臺區域的次數將由SmartV2.5軟件記錄。

1.6 懸尾實驗檢測小鼠記錄小鼠6 min內的累計不動時間

小鼠在完成水迷宮實驗后進行懸尾、O迷宮以及新事物認知實驗。實驗前3 d，實驗者對動物進行適應性接觸。實驗當天，將動物移入測試間適應30 min。將小鼠置于懸尾箱（20 cm×20 cm×30 cm），距尾尖0.75 cm用膠帶固定尾部，使小鼠頭向下懸掛，用攝像頭記錄小鼠6 min內的累計不動時間。

1.7 O迷宮實驗記錄小鼠5 min內移動距離和開臂中停留時間

O迷宮是根據動物對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態。將小鼠面對閉臂區，放置于開臂和閉臂區的接點處，記錄5 min內移動距離和開臂中停留時間。

1.8 新事物認知實驗記錄小鼠對新事物的觸碰時間、觸碰頻率、移動速度與距離

在測試期間，小鼠現放入開口方木盒（50 cm× 50 cm×25 cm）內并允許自由探索5 min以期適應環境。然后，將小鼠移入飼養籠內。5 min后，小鼠返回盒內進入受訓期。此時，有兩個完全相同的物體（彩色紙盒，大小為6.0 cm×6.0 cm×3.5 cm）于距盒壁8 cm處沿一方墻直線排開。小鼠自另外兩個拐角之一放入盒內，在自由探索5 min后再被送回飼養籠內。間歇5 min后，小鼠被再引入實驗盒內進行實驗期的自由探索。此時，兩個受訓期使用過的彩色紙盒之一被一紫色小盒（7.0 cm×7.0 cm×5.5 cm）置換并位于原位，而另一已熟悉的彩色紙盒被移至新物體相對的拐角以防止小鼠空間的偏倚。記錄小鼠對新事物的觸碰時間、觸碰頻率、移動速度和距離。

1.9 統計學分析

所有數據均用SPSS19.0統計軟件進行統計分析。數據采用多組間比較用AVONA分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，結果描述用均值表示，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Sir對KA致癇未成年小鼠海馬和皮質S6蛋白磷酸化的影響

KA造模后，給予Sir 0.3，1.0和3.0 mg·kg-1，連續7 d。與正常對照組相比，模型組海馬和皮質均出現p-S6表達增加；Sir 0.3 mg·kg-1給藥組并未見S6蛋白磷酸化明顯抑制，而Sir 1.0 mg·kg-1可顯著逆轉p-S6的過度激活（P＜0.05），Sir 3.0 mg·kg-1逆轉p-S6的過度激活作用更顯著（P＜0.01）（圖1）。在給藥后3 d、3周和5周的實驗中均得到類似結果（結果未顯示）。上述結果提示，Sir 1.0 mg·kg-1對KA致癇后誘發的mTOR信號通路異常激活均有抑制作用。因此，在后續實驗中，選取1.0 mg·kg-1作為Sir的給藥劑量。

Fig.1 Effect of sirolimus（Rapamycin，Sir）on phosphorylation of S6 protein in hippocampus（A,B）and cortex（C，D）of kainic acid（KA）-induced seizure of young mice by Western blotting.Mice were given KA 12.0 mg·kg-1（ip），and 24 h later Sir was given and sacrificed at 7 d.B And D were the semiquantitative results of A and C，respectively.x±s，n=6.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with KA model group.

2.2 低劑量Sir對KA致癇未成年小鼠海馬DCX表達和體質量無明顯影響

如圖2A～D所示，模型組小鼠海馬區DCX的陽性細胞數與正常對照組無顯著差異，Sir 1.0 mg·kg-1給藥組雖然可見陽性細胞數有一定減少但未具顯著性差異。

模型組小鼠體質量較正常對照組稍有減輕，Sir 1.0 mg·kg-1組減輕更顯著，但3組間并無顯著差異（圖3）。以上結果提示，小劑量Sir對KA致癇未成年小鼠的體質量和神經元并無顯著影響。

Fig.2 Effect of Sir 1.0 mg·kg-1on neuron development in young mice after KA induced seizure by doublecortin（DCX）immunofluorescent staining（×40）.See Fig.1 for the treatment.A-C：representative images of DCX；D：quantitative result of DCX positive cells per field in different groups.x±s，n=16.

Fig.3 Effect of Sir 1.0 mg·kg-1on body mass of young mice after KA induced seizure.See Fig.1 for the treatment.x±s，n=12.

2.3 低劑量Sir對KA致癇未成年小鼠學習記憶的影響

Morris水迷宮檢測結果顯示（圖4），與正常對照組相比，KA致癇小鼠平臺潛伏期明顯增長（P＜0.05），穿越平臺次數明顯降低（P＜0.05），游泳距離顯著延長（P＜0.05），提示空間記憶功能受損。與模型組比，Sir 1.0 mg·kg-1給藥明顯縮短平臺潛伏期和游泳距離（P＜0.05），增加穿越平臺象限次數（P＜0.05），可逆轉學習記憶功能的損害。三組間游泳速度并無顯著性差異。

Fig.4 Effect of Sir 1.0 mg·kg-1on escape latency（A），number of platform crossings（B），swimming length（C）and swimming speed（D）in young mice after KA induced seizure.Mice of 10 d of age were induced seizure and administered Sir for 4 weeks and subjected to Morris water maze experiment.x±s，n=12.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with KA model group.

2.4 低劑量Sir對KA致癇未成年小鼠累計不動時間的影響

懸尾結果顯示（圖5），與正常對照組相比，模型組小鼠6 min內的累計不動時間顯著延長（P＜0.05），Sir 1.0 mg·kg-1給藥后可縮短小鼠6 min內的累計不動時間，緩解此種焦慮抑郁狀態（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of Sir 1.0 mg·kg-1on freezing time in open arm in young mice after KA induced seizure by tail suspension test.See Fig.3 for the treatment.x±s，n=12.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with KA model group.

2.5 低劑量Sir對KA致癇未成年小鼠內移動距離和開臂中停留時間的影響

O迷宮結果顯示（圖6），與正常對照小鼠組相比，模型組小鼠移動距離縮短及在開臂中停留時間縮短（P＜0.05），Sir 1.0 mg·kg-1給藥后對上述各種異常均有不同程度的緩解（P＜0.05）。

Fig.6 Effect of Sir 1.0 mg·kg-1on migration length（A）and retention time in open arm（B）in young mice after KA induced seizure by O maze.See Fig.3 for the treatment.x±s，n=12.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with KA model group.

2.6 低劑量Sir對KA致癇未成年小鼠新事物認知實驗對新事物的觸碰時間、觸碰頻率、移動速度與距離的影響

新事物認識結果顯示（圖7），與正常對照小鼠組相比，模型組小鼠新事物認知實驗中對新事物的觸碰時間與觸碰頻率，并伴隨移動速度與距離的顯著下降（P＜0.05），Sir 1.0 mg·kg-1給藥后可緩解此種焦慮抑郁狀態（P＜0.05）。

Fig.7 Effect of Sir 1.0 mg·kg-1on retention time with new object（A），touch frequency（B），migration length（C），and average speed（D）in young mice after KA induced seizure by new object recognition test.See Fig.3 for the treatment.x±s，n=12.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with KA model group.

3 討論

在我們前期對Sir副作用的研究中發現，較大劑量的Sir可導致未成年期小鼠生長發育遲緩［23］。在本研究中，我們嘗試降低Sir劑量，從而達到降低過度激活的mTOR信號通路但又不影響生長發育的效果。本研究結果顯示，Sir 1.0 mg·kg-1則可以顯著抑制KA致癇后S6蛋白磷酸化。以DCX陽性細胞數目為指標，觀察Sir對神經元發育的影響，Sir 1.0 mg·kg-1對DCX的陽性細胞數并無顯著影響，體質量的下降無顯著意義，本課題雖并未對Sir的其他副作用（如免疫抑制作用）進行系統觀測，但上述結果提示，Sir 1.0 mg·kg-1產生的副作用并不明顯，為未成年小鼠癲癇合適的給藥劑量。在我們前期對正常10日齡大鼠使用Sir的觀察中，發現Sir 1.0 mg·kg-1對10日齡大鼠生長發育有一定延緩作用［23］，與本次實驗數據略有不同，其原因可能與KA致癇后mTOR信號通路本身過度激活有關。行為學結束后，我們又檢測了S6蛋白及其磷酸化水平，結果與7 d處死時一致，Sir 1.0 mg·kg-1能顯著逆轉KA所致信號通路激活。由此可見，行為學與p-S6水平存在一致性。

目前研究顯示，癲癇患者常伴有認知障礙和抑郁癥等癲癇共病。癲癇發生后癇樣放電干擾正常神經元間的信息傳遞，改變正常的突觸連接和回路生長，導致神經元功能紊亂；癲癇發作伴發的低氧血癥、高碳酸血癥、興奮性神經遞質過度釋放等都會導致神經元凋亡和壞死；癲癇發作后細胞因子表達異常，影響神經發生和突觸可塑性、神經組織發育異常、代謝異常以及睡障礙和神經遞質系統異常等，從而導致學習記憶功能受損［24］。在中央顳葉癲癇患者的致灶區，5-羥色胺與受體結合降低，同時還發現海馬區與扣帶回區5-羥色胺結合降低的水平影響情緒沮喪的程度［25］。癲癇與抑郁共病的發病機制，主要包括下丘腦-垂體-腎上腺軸功能失調，興奮性神經遞質谷氨酸功能失調，去甲腎上腺素和5-羥色胺傳遞缺陷等神經遞質和（或）神經病理異常［26］。可見，癲癇與認知障礙和抑郁癥等共病存在著共同的發病機制。本實驗中，在KA致癇的未成年C57BL/6小鼠中，雖未見明顯自發性癲癇發作從而無法評估Sir對癲癇的抑制作用，但在我們前期對KA致癇大鼠的研究中，發現Sir可顯著抑制KA致癇后自發性癲癇的發作［10］。本研究亦發現Sir可抑制KA致癇后學習記憶功能障礙和興奮焦慮狀態，提示mTOR信號通路可能是癲癇和癲癇后共病的共同發病機制。

綜上所述，低劑量Sir能降低KA致癇未成年小鼠mTOR信號通路的激活，并改善學習記憶功能障礙和焦慮抑郁狀態，且無明顯不良反應。

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Effective dosage of sirolimus for seizure treatment of immature C57BL/6 mice induced by kainic acid

WU Mei-ling,YANG Xin-jie,LIU Fu-rong,WANG Yu-zhi,CHEN Dan-jiao, WU Yun,ZHU Feng,ZENG Ling-hui

(School of Medicine,Zhejiang University City College,Hangzhou 310015,China)

OBJECTIVETo explore the safe and effective dose of sirolimus(Rapamycin,Sir)and its effect on seizure comorbidities.METHODSImmature C57BL/6 mice at postnatal 10 d of age were administered with kainic acid(KA)12.0 mg·kg-1intraperitoneally by a single injection to induce acute seizure.Sir 0.3,1.0 and 3.0 mg·kg-1was injected 24 h after seizure every other day until 3 d,1 week, 3 weeks,5 weeks and 6 weeks.Western blotting analysis was used to detect the expression and phos?phorylation level of S6 protein and to determine the minimum effective dose of Sir.Effect of the mini?mum effective dose of Sir on cognitive function and body growth was observed by several evaluations. Immunofluorescent intensity of Doublecortin(DCX)immunofluorescent staining was conducted to evaluate the development of neurons in the hippocampus.Morris water maze was used to assess the cognitive function.Tail suspension test,O maze and new object recognition test were used to study the anxiety-like behaviors of mice.RESULTSThe result of Western blotting showed that Sir 0.3 mg·kg-1had no significant effect on the phosphorylation of S6 protein in normal mice or KA mice,whereas 1.0 and 3.0 mg·kg-1could significantly inhibit the phosphorylation of S6 protein in KA mice(P＜0.05).Sir 1.0 mg·kg-1had no obvious effect on DCX-positive cells or body wass.Morris water maze showed that KA-induced seizure resulted in prolonged escape latency and swimming length(P＜0.05),and a decreased crossing number of target quadrant(P＜0.05).Sir 1.0 mg·kg-1significantly reversed the deficit of cognitive function of KA-induced seizure mice(P＜0.05),whereas no significant difference was found between Sir group and normal control group.Compared with normal control group,model group showed increased freezing time in tail suspension test(P＜0.05),decreased migration length and reten?tion time in open arms in O maze(P＜0.05),decreased retention time and touch frequency with new objects,migration length and average speed in new object recognition test(P＜0.05).Sir 1.0 mg·kg-1significantly reversed the above anxiety and depression status,whereas no significant difference was found between sirolimus group and normal control group.CONCLUSIONSir 1.0 mg·kg-1inhibits the abnormal activation of mTOR pathway and the formation of epilepsy comorbidity in immature mice. Along with its mild side effect in development,Sir 1.0 mg·kg-1will be an ideal dose to be used in the treatment of seizure in immature mice.

epileptic seizure;sirolimus;learning and memory;protein expression

s:ZHU Feng,Tel:(0571)88018979,E-mail:zhuf@zucc.edu.cn;ZENG Ling-hui,Tel:(0571) 88284356,E-mail:zenglh@zucc.edu.cn

R971.6

：A

：1000-3002-（2017）01-0051-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.006

2016-07-13 接受日期：2016-11-26）

（本文編輯：喬 虹）

國家自然科學基金（81371429）；杭州市科技局重大科技創新項目（20152013A02）；杭州市科技局社會公益項目（20160533B73）

吳美玲，女，碩士研究生，從事神經系統疾病藥理學研究。

朱 鋒，E-mail：zhuf@zucc.edu.cn，Tel：（0571）88018979；曾玲暉，E-mail：zenglh@zucc.edu.cn，Tel：（0571）88284356

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81371429);Hangzhou Science and Technology Major Project for Innovation(20152013A02);and Hangzhou Science and Technology Project (20160533B73)