6味中藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用

(西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌402460)

6味中藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用

馮韜，何玉張，李志強(qiáng)，喻祥，陳紅偉

(西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌402460)

采用96孔板，分別對(duì)細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)和細(xì)菌與中藥提取物共同培養(yǎng)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值來(lái)考察中藥提取物對(duì)生物膜形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參、柴胡、大青葉、白頭翁、板藍(lán)根、蒲公英6味中藥的水提液和醇提液在高濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜均有不同程度的抑制作用，其中白頭翁醇提液、板藍(lán)根醇提液、蒲公英醇提液在1倍MIC濃度下對(duì)細(xì)菌生物膜(BF)的抑制率均高于80%。

細(xì)菌生物膜;中草藥;金黃色葡萄球菌;OD值

細(xì)菌生物膜(bacterial biofilm，BF)是細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境、維持自身生命而產(chǎn)生的形態(tài)變化，從而使得細(xì)菌能夠更好地適應(yīng)外界環(huán)境的變化，許多難治性、頑固性的感染性疾病均與BF有關(guān)［1］。20世紀(jì)70年代末，生物膜理論正式形成，該理論認(rèn)為大多數(shù)細(xì)菌都能形成BF，且生長(zhǎng)在生物膜中［2］。據(jù)估計(jì)，大約65%細(xì)菌性感染是由生物膜細(xì)菌引起的［3］。因此如何抑制生物膜形成引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

金黃色葡萄球菌是各類感染常見的致病菌，易吸附于生物材料表面生長(zhǎng)并形成生物膜，常規(guī)劑量的抗生素和化學(xué)消毒劑作用無(wú)效，需加大藥物劑量和延長(zhǎng)用藥時(shí)間，但伴隨而來(lái)的是耐藥菌株的產(chǎn)生，致使感染繼而造成遷延不愈［4］。

目前研究表明，中藥在抗生物膜方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)抗生物膜中藥或有效成分的篩選，從單味藥或復(fù)方中進(jìn)一步篩選出具有抗生物膜功效的有效部位或提取特異性抗生物膜成分，探討其對(duì)生物膜形成關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的影響，有望發(fā)現(xiàn)中藥抗生物膜治療的靶點(diǎn)［5］。本文以苦參等6味清熱解毒中草藥為原料，研究其提取物對(duì)BF的抑制作用，旨在為中藥的抗生物膜研究用提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要藥品與試劑苦參、柴胡、大青葉、白頭翁、板藍(lán)根、蒲公英(購(gòu)自重慶市榮昌區(qū)石家藥房，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室顯微鑒定);結(jié)晶紫(批號(hào):20111125，成都市科龍化工試劑廠);脫氧膽酸鈉(批號(hào):20101008，重慶川東化工集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠)等。

1．2 試驗(yàn)菌株CVCC1882金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，由西南大學(xué)榮昌校區(qū)獸醫(yī)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1．3 主要儀器與設(shè)備Costar3599 96孔細(xì)菌培養(yǎng)板(上海凌初環(huán)保儀器有限公司);iMarK酶標(biāo)儀(成都百樂(lè)科技有限公司);FA2204C電子天平(上海越華科學(xué)儀器有限公司)等。

1．4 方法

1．4．1 中藥提取物的制備取白頭翁，板藍(lán)根，蒲公英、苦參、大青葉、柴胡粗粉100 g，分別加水煎煮3次，每次2 h，濾過(guò)，合并煎液，將濾液濃縮至100 mL，得藥材水提部分。取白頭翁，板藍(lán)根，蒲公英、苦參、大青葉、柴胡粗粉100 g，分別加70%乙醇加熱回流提取5次，每次3 h，濾過(guò)，合并煎液，將濾液濃縮至100 mL，得藥材醇提部分［6］。

1．4．2 測(cè)定提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值

采用96孔板微量稀釋法，設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照孔，依次加入各種中藥提取液和菌液再將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，以沒(méi)有出現(xiàn)渾濁的最小藥物濃度為最低抑菌濃度。

1．4．3 金黃色葡萄球菌BF模型的建立取出冷凍保存的菌種，待其解凍后挑取若干接種于滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜使其復(fù)活。次日再將復(fù)活后的金黃色葡萄球菌用劃線分離培養(yǎng)法接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，第3天再挑選營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上的單個(gè)菌落1～2個(gè)種入5 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日將該菌液用0．5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔蛊渖L(zhǎng)濁度達(dá)3×108CFU/mL，比濁好的菌液待用。

將備用菌液分別稀釋0、10、50、100、200、300倍的不同濃度。在96孔板1～8列四周加培養(yǎng)基做空白，2至7列所加菌液分別為稀釋了0、10、50、100、200、300倍的，做6個(gè)平行對(duì)照。將加好液的96孔板置于36℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出，將菌液傾出，用蒸餾水反復(fù)清洗后，加入0．1%結(jié)晶紫染色30 min后，將結(jié)晶紫傾出，洗凈，再加入1%脫氧膽酸鈉溶液，30 min后，測(cè)其595 nm處的OD值。以菌液濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，考察金黃色葡萄球菌BF生長(zhǎng)情況。

1．4．4 考察藥物對(duì)金黃色葡萄球菌BF形成的影響在整個(gè)96孔板的四周加40 μL稀釋的備用菌液和40 μL無(wú)菌水，中間的所有孔加入80 μL稀釋好的菌液。第2行2～6孔加入同一種藥液，用移液槍吹打混勻后吸取80 μL至第3行，以此類推到第7行，吸取80 μL棄去。2～11孔加入另一種藥液，步驟如上。相當(dāng)于每張板做2種藥，每種藥5個(gè)平行對(duì)照。然后將加好液的96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，取出，將菌液傾出，用蒸餾水反復(fù)清洗后，加入0．1%結(jié)晶紫染色30 min后，將結(jié)晶紫傾出，洗凈，加入1%脫氧膽酸鈉溶液30 min后，于595 nm處測(cè)其OD值，以藥液濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，考察BF生長(zhǎng)情況，同時(shí)做相同濃度乙醇液對(duì)照。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2．1 各種中藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC測(cè)定結(jié)果見表1。

2．2 SBF模型建立的結(jié)果如圖1所示。

圖1表示，將菌液稀釋了0、10、50、100、200、300倍進(jìn)行培養(yǎng)，取6組數(shù)據(jù)平均值下的結(jié)果。由圖1可知菌液稀釋在不同的濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌BF有一定的影響，當(dāng)菌液濃度較高時(shí)，BF生長(zhǎng)能力較弱;當(dāng)菌液稀釋100倍時(shí)，OD值為0.6± 0.02，BF生長(zhǎng)好且趨于穩(wěn)定，因此選定將菌液稀釋100倍作為后續(xù)試驗(yàn)菌液濃度。

表1 各種中藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC結(jié)果

圖1 菌液稀釋倍數(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌BF的生長(zhǎng)影響

2．3 以上述所測(cè)MIC值作為原始藥液濃度，進(jìn)行試驗(yàn)得出各種中藥對(duì)金黃色葡萄球菌BF生長(zhǎng)影響的結(jié)果(見表2)。

表2 中藥提取物在不同濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌BF的生長(zhǎng)影響(OD值:珚X±SD;抑制率/%)

從表2可知，這6味藥物提取物在高濃度下(MIC或1/2MIC)，OD值與對(duì)照組比較均顯著性降低。其中，白頭翁醇提液、板藍(lán)根醇提液、蒲公英醇提液在1倍MIC濃度下對(duì)BF的抑制率均高于80%。而在低濃度下(1/16MIC或1/32MIC)，白頭翁水提液、柴胡醇提液、大青葉水提液、大青葉醇提液的OD值反而呈現(xiàn)顯著性升高。

3 分析與討論

抗生素長(zhǎng)期大量使用所產(chǎn)生的菌株耐藥性問(wèn)題愈來(lái)愈受到人們的重視，因此，尋找能夠代替抗生素抑制生物膜生長(zhǎng)的藥物已成為時(shí)下學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。目前有關(guān)中藥干預(yù)生物膜的研究很多，周強(qiáng)等［4］的研究發(fā)現(xiàn)，苦參與頭孢他啶聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物膜有明顯清除作用。姚禹等［7］研究了白頭翁提取物對(duì)大腸桿菌生物膜的作用，發(fā)現(xiàn)白頭翁醇提液與水提液均對(duì)大腸桿菌生物膜有較好的抑制作用，其中醇提液效果優(yōu)于水提液。王翀［8］研究了柴胡皂苷D對(duì)白念珠菌和熱帶念珠菌生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D對(duì)兩種念珠菌生物膜形成均有抑制作用。汪長(zhǎng)中等［9］研究了10種中藥水提物對(duì)白念珠菌生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的蒲公英水提物和苦參水提物對(duì)白念珠菌的生物膜有明顯抑制作用。另外，單味的中藥黃蓮、黃柏、黃芩、梔子、牡丹皮、金銀花也有抑制或破壞細(xì)菌生物膜的作用［10－12］。

目前檢測(cè)BF的方式主要有銀染法、結(jié)晶紫染色法和掃描電鏡觀察法，后者可以清晰地觀察到BF的結(jié)構(gòu)，但使用價(jià)格較高且易受條件限制。銀染法一般適用于對(duì)BF的定性觀察，而結(jié)晶紫染色法常用于定量檢測(cè)［10］。本試驗(yàn)旨在探討中藥提取物對(duì)BF形成的影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理和方法選擇了結(jié)晶紫這種較為廉價(jià)的材料作為生物膜的染色劑。

本試驗(yàn)建立了可靠而穩(wěn)定的金黃色葡萄球菌BF模型，并由此考察了苦參、大青葉、柴胡等中藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌BF形成的影響。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果表明，6種中草藥的水提液和醇提液對(duì)金黃色葡萄球菌BF形成均有不同程度的影響，高濃度提取物的抑制效果顯著，白頭翁醇提液、板藍(lán)根醇提液、蒲公英醇提液在1倍MIC濃度下對(duì)BF的抑制率均高于80%。而在低濃度下(1/16MIC或1/ 32MIC)，白頭翁水提液、柴胡醇提液、大青葉水提液、大青葉醇提液的OD值反而呈現(xiàn)顯著性升高。提示部分中藥提取物可能在低濃度會(huì)促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］賈蓓蓓．金黃色葡萄球菌生物膜治療抗茵藥物研究進(jìn)展［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2014，6(12):110-112．

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［5］孔晉亮，劉曉嵐，陳一強(qiáng)，等．黃芩水煎液聯(lián)合左氧氟沙星對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的影響［J］．天津醫(yī)藥，2008，36(5):331-333．

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Inhibitory effect of extracts from sophora，radix bupleuri，folium isatidis，Pulsatilla chinensis，isatis root，dandelion on SBF

FENG Tao，HE Yu-zhang，LI Zhi-qiang，YU Xiang，CHEN Hong-wei
(Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Rongchang Campus，Chongqing 402460，China)

Bacteria were co-cultured with traditional Chinese medicine extracts in 96-well plates．OD values were determined by a microplate reader to examine the influence of traditional Chinese medicine extracts on biofilm formation．It was found the water extract and alcohol extract of sophora，radix bupleuri，folium isatidis，Pulsatilla chinensis，isatis root，dandelion at high concentrations had various inhibiting effects．The inhibition ratio of alcohol extract of Pulsatilla，isatis root，and dandelion at the concentration of 1 times of the MIC was higher than 80%．

bacterial biofilm;traditional Chinese medicine;staphylococcus aureus;OD

CHEN Hong-wei

S852．611

A

0529-6005(2017)01-0016-04

2016-03-18

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(SWU114026);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(XDJK2016B010);西南大學(xué)教育教學(xué)改革研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2014JY096)

馮韜(1994-)，男，碩士生，從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究，E-mail:15002358673@163．com

陳紅偉，E-mail:chw80926@126．com