熱應激脂多糖谷氨酰胺誘導牛睪丸支持細胞HSP72時效表達

叢霞，曲明媚，王龍光，張東君，田文儒，李華濤

(1．青島農業大學動物科技學院，山東青島266109;2．山東省肥城市畜牧獸醫局，山東肥城271600)

熱應激脂多糖谷氨酰胺誘導牛睪丸支持細胞HSP72時效表達

叢霞1，曲明媚1，王龍光1，張東君2，田文儒1，李華濤1

(1．青島農業大學動物科技學院，山東青島266109;2．山東省肥城市畜牧獸醫局，山東肥城271600)

為了探討溫和熱應激、脂多糖(LPS)和谷氨酰胺(Gln)誘導牛睪丸支持細胞(bSCs)HSP72的時效表達規律，本試驗將傳至第3代bSCs分成熱應激、LPS和Gln處理組，用CCK－8試劑盒檢測細胞活性，用RT－PCR和Western－Blot方法分別檢測處理后0、2、4、6、8、12、14h和16 h時細胞內HSP72 mRNA和蛋白表達。結果顯示，3種方式均能誘導HSP72表達，且HSP72蛋白分別在熱應激、Gln和LPS預處理后2、4h和12 h時表達量最高。結果表明，熱應激或Gln均比LPS誘導牛睪丸支持細胞HSP72表達的時間早，提示可考慮用Gln減少由LPS誘導的細胞損傷。

牛睪丸支持細胞;HSP72時效表達;脂多糖;谷氨酰胺;熱應激

牛睪丸支持細胞(bSCs)可為包括精原干細胞在內的各級生精細胞提供物理支架，對精子生成具有至關重要的作用。高溫環境、內毒素、微生物、炎癥反應及理化因素刺激都會使睪丸間質細胞損傷，從而影響生精細胞的發育和精子生成，導致雄性成年家畜繁殖力顯著下降。HSPs對細胞炎癥和熱應激等造成的損傷中發揮著十分重要的作用。有研究表明，熱應激［1］、脂多糖(LPS)［2］和谷氨酰胺(Gln)［3］均可以誘導HSP72的表達，保護細胞和器官存活，降低機體死亡率。但是，熱應激、LPS和Gln誘導牛睪丸支持細胞HSP72時效表達情況還不清楚。如果能證明HSP72時效表達的時間差異，也許可以利用HSP72分子伴侶作用。本研究以熱應激、LPS和Gln為誘導因素刺激bSCs，誘導其HSP72表達，以探討HSP72的時效表達規律，為進一步研究HSP72抗熱應激和炎癥反應的調控機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1．1 材料和試劑原代培養的奶牛犢睪丸支持細胞;CCK－8細胞活力檢測試劑盒(南京建成生物工程公司);Gln(BioBasic Inc);RNA提取試劑盒(原平皓);反轉錄試劑盒(TaKaRa公司);LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche);HSP70(sc－1060)和GAPDH(sc－48166)抗體，購自Santa Cruze;兔抗羊IgG HRP和羊抗兔IgG HRP二抗(Jackson ImmunoResearch);Western及IP細胞裂解液(碧云天生物技術研究所);其他試劑均為化學分析純試劑。

1．2 試驗方法

1．2．1 熱應激、LPS和Gln對細胞活力的影響通過檢測細胞活力篩選熱應激、LPS和Gln的作用條件。熱應激組:以34℃為空白對照組，37℃、39℃和41℃熱應激1 h后恢復4 h，立即檢測為0 h時間點。Gln組:分別用濃度為0、0．5、1、2、4 mmol/L和8 mmol/L的Gln與細胞在34℃下培養12 h。LPS組:分別用濃度為0、0．1、1、10、50 μg/mL和100 μg/mL的LPS與細胞在34℃下培養12 h。以細胞生長抑制率小于或接近10%為標準篩選誘導條件。

1．2．2 qT－PCR法檢測HSP72基因表達根據1．2．1篩選得到的條件，分別檢測熱應激、Gln和LPS處理0、2、4、6、8、10、12、14 h和16 h后細胞HSP72基因表達量(引物序列見表1)。采用2－ΔΔCt方法分析HSP72 mRNA表達量的相對變化。

表1 試驗中使用的RT－PCR引物

1．2．3 Western－Blot檢測HSP72蛋白提取各組細胞總蛋白，利用Western－Blot方法檢測和Image J軟件進行灰度分析。HSP72與GAPDH的灰度比值作為HSP72的表達量。

2 結果與分析

2．1 熱應激、LPS和Gln對bSCS活力的影響根據CCK－8檢測原理，吸光度值越高表示活細胞數越多，結合本試驗結果(表2)，選擇對細胞傷害程度較小的39℃溫和熱應激、濃度為2 mmol/L Gln和0．1 μg/mL的LPS為誘導條件。

表2 熱應激/℃、LPS(μg/mL)和Gln(mmol/L)對細胞活力的影響

2．2 熱應激對細胞HSP72基因和蛋白時效表達的影響熱應激后6 h內，顯著升高了細胞HSP72 mRNA和蛋白表達(P＜0．01)，并且二者均呈先高后低的趨勢，其中在熱應激后0 h，HSP72基因表達最高，熱應激后2 h其蛋白表達量最高(圖1)。

2．3 LPS對HSP72基因和蛋白時效表達的影響

LPS能誘導細胞HSP72基因和蛋白表達，并呈先高后低的趨勢。LPS處理后，細胞HSP72 mRNA表達在8～10 h顯著升高(P＜0．01)，而HSP72蛋白表達在處理后12 h表達最高(圖2)。

2．4 Gln對HSP72基因和蛋白時效表達的影響

Gln能使細胞HSP72基因和蛋白表達顯著升高，并呈先高后低的趨勢(圖3)。其中，Gln處理后2～6 h，細胞HSP72 mRNA表達最高，而細胞HSP72蛋白表達則在Gln處理后4 h時表達量最高(P＜0．01)。

圖1 熱應激對HSP72基因和蛋白時效表達的影響

圖2 LPS對HSP72基因和蛋白時效表達的影響

圖3 Gln對HSP72基因和蛋白時效表達的影響

3 討論

HSP72是熱休克蛋白家族(HSPs)中研究最多、最受關注的一種，其在正常細胞［4］和胚胎［5］內以低水平表達，而在熱應激情況下會迅速高表達。研究發現，大鼠腸黏膜HSP72蛋白表達水平隨著熱應激溫度的升高而增加，且呈現一定的溫度依賴效應［6］。本試驗以不同溫度熱休克處理bSCs發現，在39℃處理時，細胞存活率最接近90%，并且在2 h內誘導bSCs高表達HSP72。

大量醫學報道發現，HSP70表達和炎癥反應關系密切，HSP70表達增加后有明顯的抗炎癥作用。研究還表明，細胞內HSP72能降低LPS誘導的促炎細胞因子和炎性介質合成與釋放［7］。LPS又可降低細胞存活率或抑制細胞增殖，低濃度的LPS還能夠誘導HSP72的表達［4］。而與熱應激或Gln誘導HSP72表達不同的是，LPS誘導HSP72基因和蛋白表達的高峰分別出現在處理后的6 h和8 h，而LPS在6 h以前就已經能誘導細胞炎癥因子表達并使其出現炎癥反應［4］。這些結果說明，細胞受LPS刺激后先發生炎性反應，后引起HSP72表達，這就延緩了炎癥反應中HSP72的抗炎作用。

有研究表明，Gln可以誘導HSP70的表達［8］，可作為誘導多種細胞HSP70表達的誘導劑。早在果繩Kc細胞上試驗就發現，在Gln作用下，細胞才能最大量的表達HSP。在熱應激條件下，Gln能使果繩Kc細胞HSP表達量提高100倍。并且，Aln－Gln具有減輕全身炎癥反應的功能［9］。本試驗中，Gln誘導HSP72基因和蛋白表達的時間均早于LPS處理的細胞。因此，可以推測，用Gln預處理細胞可增加其抗炎作用。當然，Gln通過增加HSP72抗炎的機制還不清楚，以及其對機體組織是否具有和體外培養細胞一樣的作用效果等，都需要進一步深入研究加以驗證。

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［9］李春燕，廖東平，李仕強，等．丙氨酰－谷氨酰胺對重癥急性胰腺炎患者IL－6、TNF－α、D－二聚體的影響及臨床意義［J］．胃腸病學和肝病學雜志，2015，24(3):351－353．

HSP72 aging expression induced by pretreatments with heat stress，LPS and Gln in bovine testicular sertoli cells

CONG Xia1，QU Ming-mei1，WANG Long-guang1，ZHANG Dong-jun2，TIAN Wen-ru1，LI Hua-tao1
(1．College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China; 2 Veterinary and Animal Husbandry Department，Feicheng 271600，China．)

This study was aimed to investigate HSP72 aging expression pattern of bovine Sertoli cell(bSCs)induced by pretreatments with mild heat stress，LPS and Gln．The bSCs on their third generation were used and divided into heat stress，LPS and Gln stimulating groups．The cell viability was detected by CCK－8．The cellular HSP72 mRNA and its protein expression levels were detected at 0，2，4，6，8，10，12，14 and 16 h after treatments by RT－PCR and Western－Blot，respectively，The results showed that three measures of pretreatment could all induce HSP72 expression，and the highest protein expression levels were appeared at 2，4 and 12 h after heat stress，Gln and LPS pretreatment，respectively．From the above results we concluded that heat stress and Gln prestimulation can induce HSP72 expression in advance in bovine Sertoli cells，which indicate that Gln may be used for ameliorates LPS induced cellular injury．

bovine Sertoli cells;aging expression of HSP72;lipopolysaccharide;glutamine;heat stress

LI Hua-tao

S853．72

A

0529-6005(2017)01-0020-03

2016－05－26

國家自然科學基金(31572590;31502138);山東省自然科學基金(BS2015NY001);山東省高等學校科技計劃項目(J15LF03)

叢霞(1962-)，女，高級實驗師，本科，從事獸醫臨床工作，E-mail:wrtian@126．com

李華濤，E-mail:htli1986@hotmail.com