比較滴鼻與口服植物乳桿菌NC8對(duì)雛雞T淋巴細(xì)胞的影響

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林長春130118)

比較滴鼻與口服植物乳桿菌NC8對(duì)雛雞T淋巴細(xì)胞的影響

劉玉穎，楊文濤，趙亮，楊桂連，王春鳳

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林長春130118)

隨著乳酸菌等安全級(jí)微生物在食品、醫(yī)藥、飼料、養(yǎng)殖等領(lǐng)域中的應(yīng)用及不斷發(fā)展，正確認(rèn)識(shí)、使用乳酸菌顯得尤為重要。為了探尋一個(gè)最佳的乳酸菌給予途徑，以植物乳桿菌NC8為研究對(duì)象，通過滴鼻與口服兩種不同途徑，按一定劑量免疫雛雞。并對(duì)免疫后雛雞脾臟及外周血T淋巴細(xì)胞含量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，植物乳桿菌NC8能夠增強(qiáng)雛雞免疫能力，且滴鼻與口服兩種途徑相比較，滴鼻途徑效果相對(duì)顯著。

乳酸菌;T淋巴細(xì)胞;雛雞;免疫能力

乳酸菌(Lactobacillus)是以可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸為特點(diǎn)的厭氧菌，具有易于培養(yǎng)、操作簡單、安全性高等諸多優(yōu)點(diǎn)［1］。有研究表明，乳酸菌可通過與宿主免疫系統(tǒng)相互作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性，改善腸道菌群平衡，增強(qiáng)特異性抗體含量［2］，增強(qiáng)或抑制［3］T細(xì)胞的活化，以及影響細(xì)胞因子表達(dá)譜的變化。另外，乳酸菌能刺激雛雞產(chǎn)生多方面免疫反應(yīng)，提高生產(chǎn)性能［4］，并抑制腸道中食源性致病菌的繁殖。

T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞，具有多種生物學(xué)功能。主要由CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞組成。近年來發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞通過分泌各種細(xì)胞因子在自身免疫性疾病［5］、移植排斥等多種疾病的免疫應(yīng)答中具有重要調(diào)控功能。而CD8+T細(xì)胞可殺傷病毒或細(xì)菌感染的靶細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞，是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的重要效應(yīng)T細(xì)胞［6］。因此，對(duì)T淋巴細(xì)胞及其相關(guān)免疫應(yīng)答的研究具有重要意義。

植物乳桿菌NC8是從青儲(chǔ)飼料中分離的一種乳酸桿菌，本研究通過滴鼻及口服兩種不同的途徑［7］給予雛雞一定劑量的NC8，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫后雛雞脾臟及外周血T淋巴細(xì)胞表面CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的表達(dá)量，以及通過淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測免疫后雛雞脾臟T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力。以期篩選出一種最佳乳酸菌給予途徑，旨在大批量生產(chǎn)養(yǎng)殖中，為禽類飼喂乳酸菌等微生態(tài)制劑的作用和途徑提供一個(gè)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 菌株植物乳桿菌NC8由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物微生態(tài)實(shí)驗(yàn)室保存。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1日齡未接受免疫無病源雛雞50羽，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;雞籠火焰消毒，水槽、飼槽等器具嚴(yán)格蒸煮消毒，自由飲水、采食。

1．3 主要試劑與儀器RPMI－1640(GIBCO公司);胎牛血清(GBICO公司);Mouse Anti－Chicken CD8α－PE、Mouse Anti－Chicken CD3－FITC、Mouse Anti－Chicken CD4－RPE(Southern Biotech公司);淋巴細(xì)胞分離液(GE Healthcare Bio Sciences公司);PHA－P(Sigma公司);MTS(Promega公司); FACSCanto II流式細(xì)胞儀(美國BD公司);CO2培養(yǎng)箱(Hereaus公司);酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)。

1．4 NC8的活化在超凈工作臺(tái)中，用鑷子夾取白色移液槍頭沾取少量NC8凍干粉粉末，將槍頭一并投入5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧培養(yǎng)10 h后，將菌液沉淀搖起至均勻后，吸取100 μL加入5 mL MRS液體培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)10 h，測OD值約為2.3左右，取100 μL菌液進(jìn)行倍比稀釋，涂于MRS固體培養(yǎng)基，單個(gè)菌落計(jì)數(shù)，最終用1.0×109CFU/200 μL NC8菌液劑量以口服、滴鼻兩種不同途徑免疫雛雞。連續(xù)免疫3 d為1次，間隔1 d，共4次［8］。

1．5 流式細(xì)胞術(shù)檢測雛雞T淋巴細(xì)胞含量脾臟及外周血單細(xì)胞懸液的制備:(1)雛雞給予乳酸菌14 d后，翅下無菌采集外周抗凝血，等體積稀釋。處死，無菌操作剪開腹腔，分離脾臟。將200目疊好銅網(wǎng)置于35 mm無菌平皿中，加入1 mL RPMI－1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%雙抗)，取雞1/4脾臟置于銅網(wǎng)上，用平底注射器內(nèi)芯緩慢研磨得到單細(xì)胞懸液;(2)用淋巴細(xì)胞分離液對(duì)脾臟單細(xì)胞懸液及外周血進(jìn)行分離，得到的淋巴細(xì)胞層液體加入1 mL冷的RPMI－1640培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞沉淀2次后，用1 mL RPMI－1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，得到單細(xì)胞懸液，置于4℃，備用。原液50倍稀釋，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù);(3)將備好的脾臟及外周血單細(xì)胞懸液以每管1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分管，用1 mL FACS洗滌細(xì)胞沉淀2次，2 000 r/min(4℃)離心5 min，棄上清，留100 μL重懸細(xì)胞。加入稀釋好的流式抗體，混勻后4℃孵育40 min。用1 mL FACS洗滌細(xì)胞沉淀2次，留100 μL重懸細(xì)胞，BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀檢測。

1．6 MTS比色法檢測雛雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖將上述淋巴細(xì)胞懸液，按5×105Cell/100 μL體系進(jìn)行鋪板，整個(gè)操作過程需嚴(yán)格保證無菌。試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組(加RPMI－1640)、對(duì)照組(加淋巴細(xì)胞懸液)和試驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。取5×105個(gè)淋巴細(xì)胞置于96孔板中補(bǔ)加RPMI－1640至90 μL，試驗(yàn)組加入10 μL PHA－P(終濃度為10 μg/mL)，42℃，5%CO2培養(yǎng)44 h;然后加入MTS，20 μL/孔; 42℃，5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀于490 nm波長檢測各孔吸光度(A)值，并計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。SI=［(試驗(yàn)組的A值－空白對(duì)照組的A值)/ (對(duì)照組的A值－空白對(duì)照組的A值)］。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2．1 雛雞脾臟及外周血中T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化結(jié)果T淋巴細(xì)胞兩個(gè)重要的表面標(biāo)志是CD4+和CD8+，二者是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的樞紐，在免疫反應(yīng)中具有重要作用。本試驗(yàn)檢測雛雞脾臟、外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞含量以及CD4+/CD8+值。結(jié)果顯示:(1)滴鼻與口服NC8組雛雞脾臟CD4+T細(xì)胞含量與空白對(duì)照組相比均顯著(P＜0.05，圖1)升高。滴鼻與口服NC8組雛雞外周血中CD4+T含量與空白對(duì)照組相比升高差異均極顯著(P＜0．01，圖2);(2)滴鼻與口服NC8組雛雞脾臟中CD8+T淋巴細(xì)胞含量與空白對(duì)照組相比均有升高，但差異不顯著(圖1)。然而，滴鼻與口服NC8組雛雞外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞含量與空白對(duì)照組相比升高差異均顯著(P＜0．05，圖1．2);(3)脾臟與外周血淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值均顯示，滴鼻與口服NC8組雛雞與空白對(duì)照組相比均有所升高，尤其，滴鼻NC8組雛雞脾臟CD4+/CD8+比值與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0．01，圖3)，口服NC8組雛雞與空白對(duì)照組相比差異顯著(P＜0．05，圖1．3)。提示口服與滴鼻NC8均能在一定程度上增強(qiáng)雛雞免疫力，兩種途徑相比，滴鼻NC8效果相對(duì)顯著。

2．2 雛雞脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測雛雞免疫NC8 14 d后，分離脾臟淋巴細(xì)胞，MTS比色法檢測T淋巴細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，滴鼻與口服NC8組雛雞脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力與空白對(duì)照組相比均有增強(qiáng)，其中滴鼻免疫植物乳桿菌NC8極顯著(P＜0．001，圖4)增強(qiáng)了雛雞淋巴細(xì)胞增殖活性，而口服植物乳桿菌NC8與空白對(duì)照組之間差異不顯著。

3 討論

圖1 滴鼻/口服免疫植物乳桿菌NC814天后雛雞脾臟T淋巴細(xì)胞含量

圖2 滴鼻/口服免疫植物乳桿菌NC814d后雛雞外周血T淋巴細(xì)胞含量

圖3 滴鼻/口服免疫植物乳桿菌NC814d后雛雞脾臟(左)外周血(右)CD4+/CD8+比值變化

在以往的研究中，各種益生菌通過免疫調(diào)節(jié)活性具有顯著的抗菌作用，且口服乳酸菌已被證明能有效的預(yù)防流感病毒感染小鼠［9－11］。完整的細(xì)菌通過胃的酸性環(huán)境，可能會(huì)受到損傷，故有人建議鼻內(nèi)給予乳桿菌屬，可直接增加呼吸系統(tǒng)的免疫作用，進(jìn)而有效地防止呼吸道感染。有報(bào)道表明，共生細(xì)菌能保持腸道內(nèi)的免疫平衡，在呼吸道黏膜［12］通過適當(dāng)?shù)募せ钛装Y反應(yīng)調(diào)節(jié)免疫，因此對(duì)滴鼻與口服乳酸菌增強(qiáng)機(jī)體免疫能力這兩種途徑進(jìn)行比較顯得極具意義。

圖4 滴鼻/口服免疫植物乳桿菌NC8 14d后雛雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力變化

CD4+和CD8+T細(xì)胞是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的樞紐，正常值范圍內(nèi)的CD4+/CD8+值高時(shí)，表明機(jī)體處于高的免疫狀態(tài)，當(dāng)CD4+/CD8+的比例失調(diào)或缺陷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致各種免疫疾病發(fā)生。本研究中試驗(yàn)組的CD4+T淋巴細(xì)胞含量、CD4+/CD8+值均高于對(duì)照組，尤其是滴鼻NC8組極其顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明，一定劑量的植物乳桿菌NC8可以增強(qiáng)雛雞細(xì)胞免疫能力，且以滴鼻的方式免疫效果相對(duì)較好。此外，由于CD4+T細(xì)胞在功能上具有輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的作用，因此我們下一步將會(huì)對(duì)NC8提高雛雞體液免疫方面進(jìn)行研究。

本試驗(yàn)通過比較乳酸菌提高雛雞免疫能力的兩種不同途徑，旨在改善傳統(tǒng)乳酸菌飼喂模式，優(yōu)化乳酸菌在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的益生作用，以期更好的抑制病原菌和抗感染，盡量避免抗生素應(yīng)用，減少藥物殘留，促進(jìn)綠色、健康養(yǎng)殖。

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Comparison the Effect of intranasal and oral administration of Lactobacillus plantarum NC8in chicken on T lymphocytes

LIU Yu-ying，YANG Wen-tao，ZHAO Liang，YANG Gui-lian，WANG Chun-feng
(College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Jilin Provincial Engineering Research Center of Animal probiotics，Changchun 130118，China)

With the applicationand development of the safety level of microorganisms such as Lactic acid bacteria in the fields of food，medicine，feed，etc，understanding and use of lactic acid bacteria is particularly important．To develop an effective way to administratrate the lactic acid bacteria，a lactobacillus plantarum NC8 was selected in this study．After the administration of a certain dose of lactic acid bacteria by the intranasal and oral ways．then T lymphocyte in spleen and peripheral blood of chickens were analyzed test．The results showed that NC8 could enhance the immune ability of chickens，Compared with oral administration，the effect of intranasal route was relatively obvious．

Lactic acid bacteria;T lymphocytes;chicken;Immunity

s:YANG Gui-lian;WANG Chun-feng

S858．31

A

0529-6005(2017)01-0023-04

2015-07-21

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102806，2011AA10A-215);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272552，31272541，81170358);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(NCET-10-0175);吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20111816);吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項(xiàng)目(2011-Y07)

劉玉穎(1988-)，女，碩士生，主要從事動(dòng)物微生態(tài)與黏膜免疫的研究，E-mail:462532430@qq．com

楊桂連，E-mail:yangguilian@jlau．edu．cn;王春鳳，E-mail:wangchunfeng@jlau．edu．cn