雞源HPI+大腸桿菌的鑒定及黃連連翹對其的聯合抑制作用研究

王艷萍，董林，郭時金，3，徐倩倩，苗立中，李風葉，莫玲，謝金文，沈志強

(1．山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600;2．山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發推廣中心，山東濱州256600; 3．山東綠都安特動物藥業有限公司，山東濱州256600;4．山東省濱州市畜牧獸醫局，山東濱州256600)

雞源HPI+大腸桿菌的鑒定及黃連連翹對其的聯合抑制作用研究

王艷萍1，2，3，董林1，郭時金1，3，徐倩倩1，2，3，苗立中1，李風葉4，莫玲1，謝金文1，沈志強1

(1．山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600;2．山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發推廣中心，山東濱州256600; 3．山東綠都安特動物藥業有限公司，山東濱州256600;4．山東省濱州市畜牧獸醫局，山東濱州256600)

為了研究黃連和連翹對HPI+大腸桿菌的聯合抑菌作用，采用PCR方法對已知血清型的9株雞源大腸桿菌進行了HPI毒力島攜帶情況檢測，檢測出7株HPI陽性，2株陰性;采用微量稀釋法和微量棋盤法對這7株HPI+大腸桿菌進行了黃連、連翹的提取物單獨與聯合抑菌試驗。結果表明，黃連、連翹單用時，對HPI+大腸桿菌的MIC分別為125.0 mg/mL和714 mg/mL，當兩者聯合使用時，黃連、連翹的MIC分別為125.0 mg/mL和89.25 mg/mL，聯合抑菌指數FIC=1.125，表現出了無關作用。提示，黃連、連翹提取物不適合作為藥物對其進行抑菌試驗。

黃連;連翹;聯合抑菌;HPI+大腸桿菌

隨著畜牧業和動物醫療事業的發展，社會各界對嚴格使用抗生素的呼聲越來越高。毒力島最早發現于耶爾森菌屬，因與該屬菌的小鼠致死表型密切相關，故被命名為耶爾森菌強毒力島(HPI)［1－3］，與致病性大腸桿菌的毒力進化密切相關，可水平傳播［4－6］。特選取中藥黃連和連翹對HPI+大腸桿菌的聯合抑菌作用來篩選高效抗菌中藥。

1 材料與方法

1．1 藥材黃連、連翹，購自安國伊康藥業有限公司;DNA Marker DL-2 000，由寶生物工程(大連)有限公司提供;0．5麥氏比濁管、MH瓊脂、MH肉湯，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1．2 菌株大腸桿菌O2標準株由安徽農業大學饋贈，臨床分離的大腸桿菌血清型分別為O2、O112、O91、O11、O46、臨床分離20號菌、O109和O45。由山東省濱州畜牧獸醫研究院分離鑒定。

1．3 儀器RE－52AAA旋轉蒸發器，上海嘉鵬科技有限公司;SH－B 95A型循環水式多用真空泵，上海豫康科教儀器設備有限公司;ST16R離心機，美國ThermoFisher ST 16R;臺式小型離心機，Sigma; PCR儀，TAKARA TP100。

1．4 試驗方法

1．4．1 黃連、連翹的提取及濃縮稱取30 g黃連，粉碎，后加入10倍、8倍、8倍水，煎煮提取3次，每次2 h，3 000 r/min離心10 min，－0．08 Mpa濃縮。稱取25 g連翹，粉碎，加入10倍、8倍40%乙醇，超聲提取2次，每次2 h，3 000 r/min離心10 min，－0．08 Mpa濃縮。

1．4．2 HPI+菌株的鑒定大腸桿菌基因組DNA制備:分別挑取瓊脂平板上的O2標準株、O2、O112、O109、O45、O91、O11、O46和臨床分離20號菌單個菌落，接種LB液體培養基，培養10 h后，10 000 r/min離心2 min收集菌體，提取細菌基因組DNA，具體操作按百泰克生物技術(北京)有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)步驟進行。

引物設計與合成:根據GenBank中已發表的禽源大腸桿菌高致病性毒力島irp2基因序列，選取強保守性區段，設計如下特異性引物，用于irp2特異性序列PCR擴增，理論跨度約為521 bp。引物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成。

表1 irp 2引物設計

PCR擴增程序:以制備的大腸桿菌DNA為模板，以設計的PF－fyuA、PR－fyuA為引物進行PCR擴增，組合優化PCR反應體系見表2。

表2 PCR反應體系

確定最佳PCR程序:95℃4 min，94℃1 min，55℃40 s，72℃45 s，30個循環，72℃10 min，4℃終止。PCR程序結束，取5．0 μL產物用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結果。

1．4．3 制備HPI+大腸桿菌菌液將已經純化并鑒定為HPI+的大腸桿菌菌株，挑取平板上的單菌落，接種至肉湯培養基中，置37℃培養箱中，過夜培養，稀釋至每毫升含細菌1．5×105CFU。

1．4．4 測定黃連、連翹最低抑菌濃度以微量稀釋法進行:取U形底96孔板，在第1～9孔中每孔加入MH肉湯50 μL，第1孔加入藥物原液50 μL，混合均勻后，依次倍比稀釋至第9孔，自第9孔中吸取50 μL棄去。第10孔加入MH肉湯100 μL作為空白對照，第11孔加入藥物原液100 μL作為藥物對照，第12孔為菌液對照，加入MH肉湯50 μL，第1至9孔和12孔加入以上制備好的菌液，每孔50 μL，加完液后蓋上蓋，振蕩混勻，置入墊有濕潤紗布的方形盤內，于36℃培養18h～24 h后，觀察結果。

表3 微量稀釋法藥物加入方法

1．4．5 黃連、連翹聯合抑菌效果的測定微量棋盤稀釋法，基本方法同微量稀釋法。用滅菌后的96孔微孔板，在第1～6行沿X軸方向(從左到右)每孔中依次加入:普通肉湯，1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC的黃連藥液各25 μL，以同樣的方法在第A～F列沿Y軸方向(從上到下)每孔中依次加入8MIC、4MIC、2MIC、1MIC、1/2MIC的連翹提取物液、普通肉湯各25 μL，將兩藥混合均勻。然后加入制備好的菌液50 μL，使最終抗菌藥物濃度與計劃稀釋度相同，加液完畢，蓋上蓋，振蕩混勻，放入墊有濕紗布的方盤內，36℃培養18 h～24 h，觀察結果。棋盤稀釋法藥物加入方法按表3，并設立平行樣。兩種藥物組合后每孔的最終濃度則為原藥物濃度的1/4。

1．4．6 結果判定標準將U型底96孔聚乙烯微孔板放置于黑色背景下觀察，孔底如有圓點樣的渾濁沉淀物表明有細菌生長，孔內液體如不顯渾濁表明細菌被抑制生長。細菌的生長完全被抑制的抗菌藥物最低的稀釋度即為該藥物的MIC值。

2 結果

2．1 黃連、連翹提取結果將黃連提取液濃縮至30 mL，濃度為1．0 g/mL，連翹濃縮至35 mL，0．71 g/mL。

2．2 HPI+大腸桿菌篩選結果共篩選出6株irp2陽性菌株，分別為臨床分離株大腸桿菌O2、O112、O91、O11、O46、臨床分離20號菌和大腸桿菌O2標準菌株，O109和O45未檢出irp2基因。結果如圖1所示。

圖1 HPI檢測PCR電泳結果

2．3 最小抑菌濃度(MIC)

2．3．1 單藥的最小抑菌濃度結果顯示，黃連單用時的對10株細菌的最小抑菌濃度均為62．5 mg/mL，連翹單獨使用時的最小抑菌濃度均為714 mg/mL，可見，相同條件下，黃連的抑菌作用強于連翹。

2．3．2 黃連提取物與連翹提取物的聯合抑菌濃度兩藥聯合使用時，黃連提取物的MIC為62．5 mg/mL;連翹提取物的MIC為89．25 mg/mL;可見，兩藥聯用后，黃連的MIC和單用時相同，連翹的MIC降為原來的1/8。

黃連和連翹的聯合抑菌指數為:FIC指數=A藥聯合時的MIC/A藥單測時的MIC+B藥聯合時的MIC/B藥單測時的MIC=125mg/mL/125mg/mL+ 89．25mg/mL/714mg/mL=1．125，說明連翹和黃連為無關作用。評價標準:FIC指數＜0．5為協同作用;0．5～1為相加作用;1～2為無關作用;＞2為拮抗作用。注:A:連翹，B:黃連。

表4 黃連與連翹提取物對HPI+大腸桿菌體外聯合MIC

3 討論

黃連為毛莨科植物，黃連、三角葉黃連或云連的干燥根莖，秋季采挖，除去須根和泥沙，干燥，撞去殘留須根。具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效。連翹為木犀科植物連翹的干燥、成熟的果實，具有清熱解毒、消熱散結的功效。黃連和連翹對大腸桿菌均有抑菌效果，2010年李國旺［7］等采用藥敏紙片法做了黃連和連翹對雞大腸桿菌的體外抑制試驗，結果發現，兩者對雞大腸桿菌均有抑制作用，且黃連抗菌活性強于連翹。這與本試驗結果一致。

胡文舉［8］發現黃連素對1x105CFU濃度的4株大腸桿菌的MIC分別為0．75、0．5、0．375 mg/mL和1．0 mg/mL;陳志華［9］等做了黃連素對大腸桿菌O78和臨床分離株的MIC，結果為384 μg/mL和512 μg/mL。白云娥［10］等在2003年對以試管倍比稀釋法對連翹做了體外抑菌試驗，結果發現，連翹水提物對大腸桿菌的MIC為73．63 mg/mL，與本文的試驗結果稍有差異，這或許與所采取的試驗方法有關。

試驗表明，黃連水提物和連翹水提物雖各自對大腸桿菌有抑制作用，但兩者聯合卻呈現出不相關作用，說明兩者在用作抗菌藥物時不適合配伍使用，這與王婷婷［11］研究的結果相沖突，這可能與提取方法有關，本文中的連翹提取方法為超聲，而王婷婷所用方法為對黃連－連翹藥對進行索氏提取，且提取溶媒均為無水乙醇，不同的提取方法和提取溶媒提取出不同的藥物成分，這或許是兩者的區別所在。

從以上結果可知，黃連、連翹的抑菌作用對不同血清型的大腸桿菌沒有選擇性，僅從抗菌作用這方面來說，兩者呈現出無關作用，但要從機體方面來說兩者是否配伍使用，有待于更深入的研究。

［1］金文杰，鄭志明，王倩倩，等．禽源性大腸桿菌HPI irp2基因序列的擴增及比較［J］．揚州大學學報:農業與生命科學版，2005，26(3):5－7．

［2］Carniel E，Guilvout I，Prentice M．Characterization of a large chromosomal/high－pathogenicity island0in biotype1BYersinia entero-colitica［J］．J Bacteriol，1996，178(23):6743－6751．

［3］Mokracka J，Koczura R，Kaznowski A．Yersiniabactinand other siderophores produced by clinical isolates of Enterobacter spp．And Citrobacter spp［J］．FEMS Immunology and Medical Microbiology，2004，40(1):51－55．

［4］Schubert S，Rakin A，Fischer D，et al．Characterization of the integration site ofYersiniahigh－pathogenicity island inEscherichia coli［J］．FEMS Microbiol Lett，1999，179(2):409－414．

［5］Rakin A，Urbitsch P，Heesemann J．Evidence for two evolutionary lineages of highly pathogenicYersiniaspecies［J］．J Bacteriol，1995，177(9):2292－2298．

［6］Rakin A，Schubert S，Guilvout I，et al．Local hopping of IS3 elements into the A+T－rich part of the high－pathoge－nicity island inYersinia enterocolitica1B，O:8［J］．FEMS Microbiol Lett，2000，182(2):225－229．

［7］李國旺，趙恒章，苗志國．5種中藥對雞大腸桿菌的體外抑菌試驗［J］．貴州農業科學，2010，38(10):141－143．

［8］胡文舉，宋艷畫，吳伶俐．黃連素和黃芪多糖對雞源大腸桿菌的體外聯合抑菌作用［J］．中獸醫學雜志，2013(6):8－10．

［9］陳志華，陳曉生，繆小群，等．黃連素與抗菌藥物聯用對大腸桿菌體外抗菌活性的影響［J］．中國獸醫雜志，2004，40(12): 36－37．

［10］白云娥，漆小梅，楊國紅，等．連翹提取物的體外抗菌試驗［J］．山西醫科大學學報，2003，34(6):506－507．

［11］王婷婷．黃連、連翹協同抑菌配方優化及保鮮應用研究［D］．泰安:山東農業大學，2011．

Identification of E．coli HPI+and Associated Bacteriostasis of Rhizoma Coptidis and Fructus Forsythiae research

WANG Yan-ping1，2，3，DONG Lin1，GUO Shi-jin1，3，XU Qian-qian1，2，3，MIAO Li-zhong1，LI Feng-ye4，MO Ling1，XIE Jin-wen1，SHEN Zhi-qiang1
(1．Binzhou animal Science and Veterinary Medicineinstitude，Binzhou 256600，China;2．Shandong Binzhou Research，development and promotion center for Livestock and poultry propolis vaccine，Binzhou 256600，China; 3．Shandong lvduante Animal Medicine Co．，Ltd，Binzhou 256600，China; 4．Shandong province Binzhou city Animal Science＆Veterinary Medicine office，Binzhou 256600，China)

To study the MIC of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae when used in combination on HPI+E．coli，polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the HPI virulence island of the 9 strains E．coli of known serotype from chickens 7 strains of HPI was detected positive and 2 strains were negative．Bacteriostatic test alone and in combination of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae extract were performed on seven HPI+E．coli by microdilution method or microdilution checkerboard．The results showed that the MIC of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae was 125 mg/mL and 714 mg/mL on HPI+E．coli when used alone．The MIC of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae was 125 mg/mL and 89．25 mg/mL when used in combination，and Joint antibacterial index was FIC=1＜1．125＜2

Coptis chinensis;Forsythia suspense;Associated bacteriostasis;Escherichia coli of HPI+

SHEN Zhi-qiang

S852．61

A

0529-6005(2017)01-0056-04

2016－03－18

山東省自然科學基金資助項目(ZR2014CQ012);國家自然科學基金資助項目(31402243);山東省家禽產業創新團隊濱州綜合試驗站(SDAIT－11－16)

王艷萍(1979-)，女，獸醫師，碩士，從事動物疫病及綜合防治研究工作，E-mail:xiaowangyanping213@163.com

沈志強，E-mail:1297986799@qq.com