不同體型比格犬血清腫瘤標志物含量調查

劉宏，王森，黃凱，楊宗統，項路娟，王冬冬，劉永舉，王建琳，尹燕博，

(1．青島農業大學動物科技學院，山東青島266109;2．青島博隆實驗動物有限公司，山東青島266225;3．青島農業大學生命科學學院，山東青島266103)

不同體型比格犬血清腫瘤標志物含量調查

劉宏1，王森1，黃凱2，楊宗統1，項路娟2，王冬冬1，劉永舉3，王建琳1，尹燕博1，2

(1．青島農業大學動物科技學院，山東青島266109;2．青島博隆實驗動物有限公司，山東青島266225;3．青島農業大學生命科學學院，山東青島266103)

本試驗擬對大、中、小體型3個品系的健康成年比格犬血清腫瘤標志物AFP、CEA、CA125、CA153、CA199進行檢測，用犬腫瘤標志物AFP、CEA、CA125、CA153、CA199 ELISA試劑盒，對97只健康成年大體型比格犬、228只中體型比格犬、63只小體型比格犬的血清進行相關腫瘤標志物濃度測定，為比格犬腫瘤模型篩選提供參考。試驗結果表明，小體型比格犬血清中AFP、CA125、CA153、CEA的濃度明顯低于其他兩個品系犬(P＜0．05);而CA199的濃度明顯高于中體型比格犬(P＜0．05)。大體型比格犬血清中AFP、CEA、CA125、CA153的濃度最高，小體型比格犬血清中CA199最高，推測認為大體型比格犬患消化系統和生殖系統腫瘤的風險較高，小體型比格犬患腺癌的風險較高。

比格犬;血清;腫瘤標志物;ELISA

腫瘤是一類危害人類身體健康的疾病，尤其是惡性腫瘤，其高發病率和高死亡率嚴重威脅著人類生命安全及身心健康，腫瘤的防治是目前生物與醫學領域的研究熱點和難點。由于腫瘤發生機制非常復雜，受多因素影響，導致治療時機把握與治療效果不佳，故早期發現和早期診斷成為腫瘤的治療的關鍵。

目前臨床應用的X線檢查、超聲檢查、CT檢查、核磁共振檢查、內腔鏡檢查等手段能從不同角度對腫瘤進行診斷，可在一定程度上提高腫瘤的早期診斷率，但又各有其局限性［1］。腫瘤標記物(tumor marker，TM)是在惡性腫瘤發生和增殖過程中，由腫瘤細胞的基因表達而合成分泌的或是機體對腫瘤反應而異常產生和/或升高的，反映腫瘤存在和生長的一類物質，包括蛋白質、激素酶、多胺及癌基因產物等［2］。腫瘤標志物特異性強，僅能在腫瘤組織細胞中產生，正常組織細胞中不存在，且腫瘤標志物敏感性高，僅有少量存在時即可被檢測到，有助于腫瘤的篩選及早期診斷。臨床上，以腫瘤標記物進行的診斷已經成為腫瘤患者的重要檢查指標［3］。

在國內外的科研工作中，比格犬被廣泛應用于醫學、生物學、病理學、腫瘤學、免疫學、藥理學、生物化學等生命科學領域［2］，用于人類相關疾病的發生機制、篩選治療藥物，是人類疾病研究最好的動物模型［4］。但在生理條件下，比格犬主要血清相關腫瘤標志物是否存在?不同品系之間是否相同?目前還未檢索到相關文獻報道。

本研究擬對不同體型品系健康比格犬的主要血清相關腫瘤標志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、乳腺癌標記物(CA153)、卵巢癌抗原(CA125)、胰腺癌敏感標記物(CA199)進行測定與比較，以豐富比格犬的生理學內容，并為不同腫瘤模型建立的比格犬選擇奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 實驗動物12月齡以上，大體型比格犬90只，體重18～23 kg;12月齡以上，中體型比格犬228只，體重13～17 kg;12月齡以上，自繁小體型比格犬64只，體重9～12 kg。此次實驗用比格犬均由青島博隆實驗動物有限公司提供［SCXK(魯)2012-0003］。

1．2 儀器與試劑電動臺式離心機(80－2，上海梅香儀器有限公司);酶標儀(318C+，上海沛歐分析儀器有限公司);5種腫瘤標志物檢測試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司。

1．3 方法每只比格犬前肢內側靜脈處采集血液2 mL，300 r/min×g離心5 min，取上清液待測。向96孔板中加入準備好的待測樣品和標準品，37℃反應30 min;洗板5次，加入酶標試劑，37℃反應30 min;洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10 min;加入終止液，用酶標儀測定OD值，通過標準品制備曲線，計算待測樣品濃度。

1．4 統計分析數據用GraphPad Prism Program 6 (GraphPad Software，San Diego，CA)軟件進行統計，P＜0．05為差異顯著。

2 結果

不同體型品系成年比格犬血清中都含有AFP、CEA、CA153、CA125、CA199，且這5種腫瘤標志物的濃度差別較大。不同體型品系比格犬間血清中AFP的含量主要集中到10～33 μg/L，不同品系之間差別較大，但大體型品系與中體型品系比格犬之間無統計學差異，而小體型品系與其他兩種品系之間差異顯著(P＜0．05)(見圖1)。不同體型品系比格犬間血清中CEA的含量主要集中到10～21 μg/L，不同品系之間存在一定差別，但大體型品系與中體型品系比格犬之間無統計學差異，而小體型品系與其他兩種品系之間差異顯著(P＜0．05)(見圖2)。

圖1 不同體型成年比格犬血清AFP含量

圖2 不同體型成年比格犬血清CEA含量

不同品系成年比格犬血清中CA153濃度大部分集中到3～9 U/L之間，且大體型品系與中體型品系之間的CA153含量相似，而小體型與大體型、中體型比格犬血清中CA153濃度有顯著性差異(P＜0．05)(見圖3)。不同品系成年比格犬血清中CA125濃度大部分集中到6～21 U/L之間，且大體型品系與中體型品系比格犬之間無明顯差別，小體型與大體型、中體型比格犬血清中CA125濃度有顯著性差異(P＜0．05)(見圖4)。不同品系成年比格犬血清中CA199濃度大部分集中到7～16 U/L之間，且大體型品系與中體型品系和小體型品系之間無明顯差別(P＞0．07)，而小體型品系成年比格犬血清中CA199的含量顯著高于中體型品系成年比格犬(P＜0．05)(見圖5)。

圖3 不同體型成年比格犬血清CA153含量

圖4 不同體型成年比格犬血清CA125含量

圖5 不同體型成年比格犬血清CA199含量

3 討論

自20世紀80年代以來，各種腫瘤標志物相繼在臨床應用于腫瘤的診斷，腫瘤標志物的檢出具有高效、方便、標本易獲取等優點，同時也為組織學分型、臨床分期、預后判斷和療效檢測等提供重要的應用價值［5］。比格犬作為重要的人類腫瘤研究的重要模型，已有報道人工誘發比格犬肺癌、肝癌、骨癌和乳腺癌等用于人類腫瘤模型的研究［6－7］，且也有比格犬患乳腺癌［8］等腫瘤疾病的研究報道，且大部分的研究報道主要集中到腫瘤的發生機制和臨床病例方面，而無生理狀態下腫瘤標志物檢測的相關報道。

腫瘤標志物最重要的價值是能明確手術、放療和藥物治療是否有效，有的還可反映腫瘤殘留量，故檢測腫瘤標志物的濃度可為臨床提供重要的信息。不同類型腫瘤具有不同的腫瘤表面標志物質，目前常見的血清腫瘤標記物主要包括AFP、CEA、CA153、CA125、CA199等。AFP是有胚肝細胞核卵黃囊產生的甲胎蛋白，在發生肝細胞癌、卵黃囊和胚胎性腫瘤時其血清濃度升高，是目前為止診斷原發性肝癌最敏感的標志物［9］。CEA為基因編碼于19號染色體上的具有人類抗原決定簇的酸性糖蛋白，為胚胎性致癌抗原，于1965年發現，被認為是結腸癌的標志物［10－11］，但是后來被認為在各種消化道腫瘤均有所表達。單項腫瘤標記物的檢測可能會造成腫瘤的漏診或誤診，多種標記物聯合檢測可提高腫瘤的檢出率。研究認為AFP和CEA聯合診斷原發性肝癌的陽性率和特異性明顯高于單獨檢測AFP。本研究中，不同體型品系成年比格犬血清中AFP和CEA都具有明顯的差別，但二者在不同品系比格犬種變化相似，且大體型品系犬最高，而小體型品系犬的濃度明顯低于其他品系犬。這表明，AFP和CEA的濃度可作為肝癌和(或)結腸癌的重要標志物質，在大體型比格犬中濃度最高，表明該品系犬對消化系統腫瘤較為敏感，可作為消化系統腫瘤研究的模型動物。

CA125最初從上皮性卵巢癌檢測出的一種糖蛋白，主要應用于卵巢癌的診斷和隨訪，其他惡性腫瘤患者血清CA125的水平也會升高，其他疾病如炎癥、肝硬化等非惡性腫瘤時，CA125可有不同程度的升高，但一般低于正常值［12］。CA153是乳腺癌的特異性指標，其濃度增高提示患有乳腺癌、肺癌、腎癌、消化道腫瘤、評巢癌的可能性，其水平變化與乳腺癌診斷、復發相關［13］。本研究中不同體型品系成年比格犬血清中AFP和CEA都具有一定的差別，其中大體型品系和中體型品系犬相似，而在小體型品系犬中的含量明顯低于其他品系。這表明，CA125和CA153的濃度可作為卵巢癌和乳腺癌等生殖系統腫瘤的重要標志物質，在大、中體型比格犬中濃度較高，而小體型品系犬中最低，表明小體型品系犬對生殖系統腫瘤較不敏感，不建議作為生殖系統腫瘤研究的模型動物。

CA199是由Koprowski于1979年用結腸癌細胞株SW1116免疫BALB/c小鼠而得到的一株腫瘤特異性單克隆116－NS199。正常人血清中含量極微，當患者肝、膽、胰等疾病時即會出現含量升高，它對腫瘤的療效觀察、預后判斷、復發和轉移均有十分重要的臨床價值。1983年Del Villano等首先描述了血清CA199對胰腺癌的診斷意義，CA199為與腺癌高度相關的物質，由腺癌細胞產生，胰腺癌、胃癌伴轉移過程中CA199明顯升高［9］。本研究中不同體型品系成年比格犬血清中CA199都具有一定的差別，其中在中體型品系含量最低，而在小體型品系犬中的含量最高，且明顯高于中體型品系犬。這表明，CA199的濃度可作為腺癌，尤其是胰腺癌的重要標志物質，在大、中體型比格犬中濃度較低，而小體型品系犬中最高，表明小體型品系犬對胰腺癌等腺癌相關腫瘤的發生較敏感，可作為腺癌腫瘤研究的模型動物。

綜上研究結果表明，不同體型品系成年比格犬血清腫瘤標志物AFP、CEA、CA125、CA153、CA199的濃度存在一定差異，大體型品系比格犬腫瘤標記物較高可作為多種腫瘤模型的研究，這為篩選比格犬品系作為腫瘤研究提供了重要的基礎，同時對比格犬作為實驗動物的品系繁育具有重要的指導意義。

［1］李策，聶彩輝，張力君，等．腫瘤標志物的應用及其篩選技術研究進展［J］．藥學進展，2014，38(1):1-13．

［2］靳曉亮，楊波，關方霞，等．腫瘤與腫瘤標志物研究中證據的思考［J］．醫學與哲學，2009，30(2):48-50．

［3］時廣利，胡秀玲，岳思東，等．血清腫瘤標志物在肺癌輔助診斷中的應用［J］．中華腫瘤雜志，2005，27(5):299-301．

［4］宋潔，曹燕，黃茜．國內比格犬的生物學指標研究及相關應用進展［J］．醫學動物防制，2012，28(6):650-652．

［5］Hatzakis K D，Fmudarakis M E，Bouros D，et al．Prognostic value of serum tumor markers in patients with lung cancer［J］．Respiration，2002，69:9-25．

［6］Wilson D A，Mohr L C，Frey G D，et al．Lung，liver and bone cancer mortality after plutonium in beagle dogs and nuclear workers［J］．Health Phys，2010，98(1):42-52．

［7］Wilson D A，Diel J H，Hoel D G．Lung fibrosis and lung cancer incidence in beagle dogs that inhaled 238PuO2 or 239PuO2［J］．Health Phys，2009，96(4):493-503．

［8］Kwapien R P，Giles R C，Geil R G，et al．Malignant mammary tumors in beagle dogs dosed with investigational oral contraceptive steroids［J］．J Natl Cancer Inst，1980，65(1):137-144．

［9］湯欽樅，魏祥坤．血清AFP、CEA、CA125、CA199在原發性肝癌的診斷中的應用價值［J］．海南醫學院學報，2009，15(11): 1395-1397．

［10］Gold P，Freedom S O．Demonstration of tumor specific antigens in human colonic carcinoma by immunological tolerance and absorption techniques［J］．EXP med，1965，121:439-462．

［11］Juntermanns B，Radunz S，Heuer M，et al．Tumor markers as a diagnostic key for hilar cholangiocarcinoma［J］．Eur J Med Res，2010，15(8):357-361．

［12］王海燕，朱正學，肖燕，等．非小細胞肺癌血清中CA125、CEA的濃度及意義［J］．中國肺癌雜志，2008，11(1):97-100．

［13］田滿福，韓波．檢測CA199、CA125、CA153及CEA在腫瘤診斷中的意義［J］．臨床和實驗醫學雜志，2010，9(7):483-485．

［14］吳榮芳．聯合檢測膽汁中CEA、CA19－9、CA72－4對膽管癌的診斷價值［D］．泰安:泰山醫學院，2011．

S858.292

B

0529-6005(2017)01-0075-03

2016-01-18

“十二五”農村領域國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2012AA101303)

劉宏(1988-)，女，碩士，主要從事預防獸醫學研究，Email:liuhong_22188@163．com

王建琳，Email:bjsxxw@126．com;尹燕博，Email: yanboyin2011@163．com