脂肪酶交聯聚集體的制備及其催化合成月桂酸淀粉酯的研究

陳海龍，田耀旗，李丹，金征宇*

1(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 3(紹興市食品藥品檢驗研究院，浙江 紹興，312000)

脂肪酶交聯聚集體的制備及其催化合成月桂酸淀粉酯的研究

陳海龍1,2，田耀旗1,2，李丹1,3，金征宇1,2*

1(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 3(紹興市食品藥品檢驗研究院，浙江 紹興，312000)

采用交聯酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates, CLEAs)技術制備了脂肪酶CLEAs，優化了制備條件：以硫酸銨為沉淀劑，以14 mmol/L戊二醛為交聯劑，交聯時間1.5 h，所得脂肪酶CLEAs的相對酶活力達到41.89%；與游離酶相比，脂肪酶CLEAs的熱穩定性顯著增強，重復使用性顯著提高，重復使用10次后相對酶活力達到50.26%。以該脂肪酶CLEAs作為催化劑，以玉米淀粉和月桂酸為原料，進行了酯化反應，得到月桂酸淀粉酯的最大取代度為0.151。此外，利用紅外光譜(Fourier transform infrared spectoscopy，FT-IR)對月桂酸淀粉酯進行了分子表征，發現在1 713 cm-1處出現了羰基CO的特征吸收峰，說明月桂酸與淀粉在脂肪酶CLEAs的催化作用下合成了月桂酸淀粉酯。同時，熱重分析(TGA)表明，相比于原淀粉，酯化產物的熱穩定有較低趨勢。

脂肪酶；交聯酶聚集體；酯化；月桂酸淀粉酯

淀粉是由多葡萄糖單元組成的天然高分子碳水化合物，具有較強的親水性，限制了其工業化應用，通常需要通過酯化、醚化、氧化等方法進行改性。酯化淀粉是通過淀粉結構中的羥基與酸發生酯化反應后得到的一類變性淀粉。相比于傳統的化學合成法，脂肪酶法合成淀粉酯具有條件溫和、綠色無毒、產物易于分離純化等優點，在食品、醫藥、化工等領域有著廣泛的潛在應用。作為一種新型的無載體固定化酶技術，CLEAs[1]技術無需其他載體，對酶的純度要求低，操作簡單，成本較低。目前，關于脂肪酶法合成淀粉酯的研究主要集中于不同底物和反應體系[2-3]、制備工藝的優化[4]以及反應動力學分析[5]等方面，淀粉酯通常是由商業化固定脂肪酶催化合成的，而尚未有利用脂肪酶CLEAs催化合成淀粉酯的報道。

本研究對脂肪酶CLEAs的制備工藝進行了優化，并研究了其熱穩定性和重復使用性；其次在脂肪酶CLEAs的催化作用下，以玉米淀粉和月桂酸為原料，考察了不同條件對產物取代度的影響，同時對淀粉酯產物進行了分子表征，以期為淀粉酯的酶法高效合成提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

普通玉米淀粉，杭州普羅星淀粉有限公司；月桂酸、無水乙醇、戊二醛、乙二醇二甲醚、叔丁醇、丙酮、異丙醇、DMSO、(NH4)2SO4等試劑均為分析純，上海國藥集團；棕櫚酸對硝基苯酯(p-Nitrophenyl palmitate，p-NPP)，上海阿拉丁有限公司；豬胰腺脂肪酶，Type II，美國Sigma-Aldrich公司。

傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR，5DXC)，美國Nicolet公司；熱重分析儀(TGA，TGA/SDTA851e)，瑞士Mettler-Toledo公司；高速冷凍離心機(BIOFUGEPRIMOR)，美國Thermo Electron有限公司；雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901)，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 交聯酶聚集體的制備

參考CAO[6]等人的方法并略做改進。取9 mL的沉淀劑于離心管中，逐滴加入1 mL的脂肪酶液(pH 7.5，0.05 mol/L)，25 ℃下水浴振蕩沉淀1.0 h，然后加入戊二醛溶液，在25 ℃下繼續振蕩交聯，將混合物在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，去掉上清液，用磷酸緩沖液清洗3次以除去殘留的戊二醛及未交聯的脂肪酶。將得到的沉淀重懸于緩沖液或冷凍干燥后，于4 ℃冰箱中冷藏備用。

(1)

1.2.2 脂肪酶水解活性的測定

參考VORDERWüLBECKE[7]等人的方法并略做改進。將90 mgp-NPP溶解于30 mL異丙醇中，與450 mL磷酸緩沖液(pH 7.5，0.05 mol/L)混合均勻，然后取1 mL上述混合溶液，預熱5 min后加入1 mL稀釋酶液，37 ℃下恒溫水浴反應5 min，立即加入2 mL乙醇以終止反應，于410 nm處測定吸光度，平行測定3次。同時以1 mL磷酸緩沖液作為空白對照。在一定條件下，每分鐘分解底物p-NPP產生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量定義為1個酶活力單位。

1.2.3 熱穩定性與重復使用性的測定

取一定量的游離酶和固定化酶分別置于30、40、50、60、70 ℃的水浴鍋中溫育2 h，參照1.3.2的方法測定殘余酶活，并定義初始酶活為相對酶活100%。

取一定量的固定化酶加入底物溶液中，于37 ℃條件下反應5 min，過濾出酶并用磷酸緩沖液清洗，然后重新加入新的底物溶液，參照1.2.2的方法測定酶活。重復上述操作10次，并測定每次反應結束之后的殘余酶活。將第一次反應的酶活力定義為100%。

1.2.4 月桂酸淀粉酯的合成

參考ZARSKI[8]等人的方法并略做改進。普通玉米淀粉于105 ℃烘箱中過夜干燥后，在二甲基亞砜中加入5%(w/v)的淀粉，90 ℃條件下充分攪拌1 h使淀粉溶解，然后將溶液冷卻至反應溫度，加入月桂酸、脂肪酶交聯聚集體20%(w/w)，水浴振蕩反應4 h。反應結束后，離心除去交聯酶聚集體，在上清液中攪拌加入無水乙醇，將淀粉酯沉淀析出，并用乙醇洗滌3～4次，再用丙酮洗滌分散，沉淀在60 ℃烘箱中過夜干燥，研磨粉碎獲得淀粉酯。

1.2.5 月桂酸淀粉酯取代度的測定

參考MILADINOV[9]等人的方法并略做改進。準確稱取0.5 g樣品置于150 mL錐形瓶中，加入5 mL乙醇和25 mL去離子水，以及25 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，在室溫下振蕩60 min，然后加入2～3滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L的標準HCl溶液滴定至粉紅色剛好消失，記錄消耗的HCl體積，平行測定3次。同時以原淀粉作為空白試驗。計算公式如下：

(2)

式中：DS，取代度，定義為每個D-吡喃葡萄糖殘基中的羥基被取代的平均數量；162，葡萄糖酐單元的分子量；183，月桂酸酰基的分子量；c，標準HCl的摩爾濃度，mol/L；m，干樣品的質量，g；V0，滴定空白液用去的標準鹽酸的體積，mL；V1，滴定樣品消耗的標準鹽酸的體積，mL。

1.2.6 傅里葉轉換紅外光譜(FT-IR)

采用KBr壓片法制樣，分別將原淀粉與月桂酸淀粉酯粉末與干燥的KBr按合適的比例混勻，在紅外燈下使用瑪瑙研缽將其研磨成細粉，轉移至壓片機模具中，使用壓片機將樣品壓制成均勻薄片。以空氣作為空白，將薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀中掃描。紅外光譜儀掃描波數范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數32次，分辨率為4 cm-1。

1.2.7 熱重分析(TGA)

分別稱取3～4 mg的原淀粉與月桂酸淀粉酯于坩堝中，置于熱重分析儀系統中。設置氮氣流量為20 mL/min，升溫范圍為50～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.2.8 數據分析

所有數據均為至少3次實驗的平均值，誤差均為對應的標準偏差；利用Origin 8.5 軟件對數據進行圖表繪制和統計分析。

2 結果分析

2.1 固定化酶的制備與性質表征

2.1.1 固定化酶的制備

CLEAs的制備過程主要包括：先利用蛋白沉淀劑將溶解狀態的酶進行物理沉淀形成聚集體，再利用交聯劑與酶發生交聯反應生成不溶的CLEAs。其中，沉淀劑種類、交聯時間、戊二醛濃度和酶濃度對CLEAs的最終酶活影響較大。

沉淀過程是CLEAs制備步驟中關鍵的第一步。常用的蛋白沉淀劑主要包括中性鹽、有機溶劑和非離子型聚合物3類。沉淀劑對不同過程中酶活力的影響如表1所示。首先，加入沉淀劑使酶發生沉淀聚集，再將沉淀后的酶聚集體重新溶解回游離酶狀態，考察此時復溶聚集體的相對酶活力。異丙醇做沉淀劑時復溶酶活高達101.37%，甚至出現了超酶活現象[10]。然后，又考察了沉淀劑對CLEAs最終酶活力的影響。以硫酸銨做沉淀劑時，所得到的CLEAs的最終活性卻是最高的，達到41.89%。沉淀步驟的最佳沉淀劑并不是制備CLEAs所需的最佳沉淀劑，其原因可能是：一、沉淀步驟形成的酶聚集體可能處于一種不利于反應的狀態，但是當它們復溶于緩沖液后卻會表現出正常的活性；二、當酶聚集體被交聯后，會以這種不利于反應的狀態保留下來，并且表現出很低的活性[11]。因此，選取硫酸銨作為沉淀劑。

表1 不同沉淀劑對復溶聚集體及CLEAs相對酶活力的影響

交聯時間是CLEAs制備過程中的重要影響因素之一。由圖1(a)可知，制備脂肪酶CLEAs的最佳交聯時間為1.5 h。當交聯時間小于1.5 h時，時間的延長有利于酶分子的固定，生成的CLEAs酶活也逐漸上升；超過1.5 h后，由于CLEAs的過度交聯，導致其相對酶活力開始下降。

戊二醛是制備CLEAs的過程中最常用的交聯劑。戊二醛對酶的交聯主要是通過其兩端的醛基和酶分子表面的α-賴氨酸發生共價結合，得到不溶的交聯酶聚集體。戊二醛濃度過低時，交聯不充分，得到的交聯酶聚集體量較少，容易造成酶固定量的損失；但是當濃度過高時，酶分子間及分子內易發生交聯，戊二醛甚至會與酶活性中心結合，造成酶活性的下降。如圖1(b)所示，戊二醛濃度為14 mmol/L時獲得的固定化酶相對酶活力最高。

酶濃度主要影響著CLEAs的顆粒大小。如圖1(c)所示，隨著酶濃度的增大，CLEAs的相對酶活力也逐漸升高；當酶濃度高于30 mg/mL時，CLEAs的活力開始下降，這可能是因為形成的酶聚集體顆粒逐漸增大，造成擴散限制，阻礙了底物分子與酶活性中心的接觸。因此，選用30 mg/ mL的酶液來制備CLEAs。

圖1 交聯時間(a)、戊二醛濃度(b)、酶濃度(c)對CLEAs相對酶活力的影響Fig.1 Effects of the cross-linking time(a), concentration of glutaraldhyde(b) and enzyme concentration (c) on relative activity of CLEAs

2.1.2 固定化酶的熱穩定性及重復使用性

2.1.2.1 固定化酶的熱穩定性

實驗考察了(a)游離脂肪酶和(b)CLEAs在不同溫度下的熱穩定性，結果如圖2所示。隨著溫度的升高，游離酶和CLEAs的活力均呈現下降趨勢，但是CLEAs的熱穩定性遠高于游離酶。在70 ℃，保溫2 h的條件下，游離酶只保留了21.40%的活性，但是CLEAs仍保留54.88%的活性。這是由于酶分子之間發生交聯之后，分子之間連接更緊密，酶失活需要克服更多的非共價及共價作用力，同時酶分子內部基團的熱振動減小，酶分子發生熱伸展變性的可能性變小，因此CLEAs的熱穩定性增強，抗熱變性能提高。

圖2 游離酶(a)和CLEAs (b)的熱穩定曲線Fig.2 Thermal stabilities of free enzyme (a) and CLEAs (b)

2.1.2.2 固定化酶的重復使用性

CLEAs的重復使用性如圖3所示。隨著使用次數的增多，CLEAs的酶活力逐漸降低，使用前5次其酶活力降低較快，但是之后，其酶活力損失很小。這可能是因為：CLEAs在制備的過程中，部分酶分子間并未發生交聯，而只是吸附在其表面，在重復回收的操作過程中可能會發生酶的泄露及部分活性損失；使用10次后，固定化酶不再泄露并且保持穩定，CLEAs仍保持50.26%的相對酶活力。

圖3 CLEAs的重復使用性Fig.3 Reusability of CLEAs

2.2 淀粉酯的制備與結構表征

2.2.1 月桂酸淀粉酯的制備

取代度，是指淀粉的每個葡萄糖單元上的活性羥基被取代的物質的量。由于淀粉分子中每個脫水葡萄糖單元上只有3個羥基能被取代，所以取代度的理論值最大是3。表2是在不同反應溫度和月桂酸/ AGU摩爾比的條件下，得到的月桂酸淀粉酯的取代度。隨著溫度的升高，產物取代度不斷減小，其主要原因是因為溫度高于60 ℃時，脂肪酶的穩定性降低，酶發生了熱失活；隨著月桂酸/AGU摩爾比的不斷增大，月桂酸相對于淀粉是過量的，月桂酸的濃度變大，反應平衡也就向著正方向移動，因此產物的取代度不斷增大。本實驗結果表明，在溫度為60 ℃、底物摩爾比為3∶1時，月桂酸淀粉酯的取代度最高為0.151。

表2 反應溫度及月桂酸/AGU的摩爾比對月桂酸淀粉酯取代度的影響

2.2.2 月桂酸淀粉酯的結構表征

2.2.2.1 紅外光譜分析

圖4為(a)原淀粉和(b)月桂酸淀粉酯的紅外光譜圖。圖4(a)玉米原淀粉在3 419 cm-1處有一寬峰，為淀粉葡萄糖殘基(AGU)上O—H的伸縮振動；2 930 cm-1出現的吸收峰為C—H的伸縮振動；1 157 cm-1、1 081 cm-1、1 017 cm-1為C—O的伸縮振動吸收峰。與圖4(a)原淀粉相比，圖4(b)月桂酸淀粉酯在1 713 cm-1附近出現了一個新的吸收峰，這是羰基的特征吸收峰，表明淀粉AGU上—OH與月桂酸之間發生了酯化反應。同時，月桂酸淀粉酯在3 419 cm-1左右的吸收峰強度變小，這是淀粉AGU上—OH被酯化形成的CO部分取代的結果。

圖4 原淀粉(a)和月桂酸淀粉酯(b)的紅外光譜Fig.4 FT-IR spectra: native starch (a) and starch laurate (b)

2.2.2.2 熱重分析

原淀粉和月桂酸淀粉酯的TG及DTG曲線如圖5所示。

圖5 原淀粉(a)和月桂酸淀粉酯(b)的TG及DTG曲線Fig.5 TG and DTG curves: native starch (a); starchlaurate (b)

原淀粉與月桂酸淀粉酯的第1個熱失重過程發生于100 ℃左右，這是淀粉中結晶水蒸發的結果；而由于淀粉鏈裂解而產生的第2個失重過程則發生于270 ℃左右，且月桂酸淀粉酯的起始裂解溫度低于原淀粉。原淀粉與月桂酸淀粉酯的最大裂解溫度分別為309、320 ℃。通過比較原淀粉和月桂酸淀粉酯的裂解溫度，可以發現酯化反應降低了產物的熱裂解溫度，導致其熱穩定性下降。這也進一步證實了淀粉與月桂酸成功發生了酯化反應，生成了月桂酸淀粉酯。

3 結論

(1)以硫酸銨為沉淀劑，以14 mmol/L戊二醛為交聯劑，交聯1.5 h，得到的CLEAs相對酶活力達到41.89%；與游離酶相比，重復使用10次后相對酶活力50.26%，具有良好的重復使用性。

(2)以普通玉米淀粉和月桂酸為原料，利用脂肪酶CLEAs為催化劑合成了月桂酸淀粉酯，結果表明，在60 ℃和底物摩爾比為3∶1時，月桂酸淀粉酯的取代度達到0.151。

(3)通過FT-IR、TGA對產物進行結構表征，證明月桂酸與淀粉發生了酯化反應，生成了月桂酸淀粉酯。

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Preparation of cross linked lipase aggregates for synthesis of starch laurate

CHEN Hai-long1,2, TIAN Yao-qi1,2, LI Dan1,3, JIN Zheng-yu1,2*

1 (State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2 (School of Food Science and Technology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)3(Shaoxing Testing Institute of Food and Drug, Shaoxing 312000, China)

In this work, lipase-cross linked aggregates (lipase-CLEAs) were prepared and the effects of the precipitation and cross-linking on CLEAs activity were investigated. The optimum conditions for immobilization process were obtained as follows: ammonium sulfate was used as precipitant,concentration of cross-linker and enzyme respectively was 14 mmol/L and 30 mg/mL,cross-linking time was 1.5 h. The maximum activity recovery was 41.89% for the lipase-CLEAs. Compared with free enzyme, the thermal stability of CLEAs was largely enhanced and the reusability was significantly improved to 50.26% of their initial activity after 10 recycles. Then maize starch was esterified with laurate by using lipase-CLEAs as catalyst. The effects of the reaction temperature and the molar ratio of lauric acid/anhydroglucose unit (AGU) in starch on the degree of substitution (DS) of starch laurate were studied. The product with the highest DS of 0.151 was prepared under the given conditions. Fourier transform infrared (FTIR) analysis showed that a new peak at 1 713 cm-1for CO stretching in the ester group was observed, which confirmed the formation of starch laurate. Furthermore, decrease of thermal stability of the starch laurate was indicated by thermal gravimetric analysis (TGA).

lipase; Cross-linked enzyme aggregates; esterification; starch laurate

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702004

碩士研究生(金征宇教授為通訊作者，E-mail：Jinlab2008@yahoo.com)。

國家自然科學基金項目(31230057)

2016-09-18，改回日期：2016-11-01