茴香醚對雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis LUGU)蝦青素積累和脂肪酸合成的影響

丁巍，尚敏敏，余旭亞，趙鵬，李濤，徐軍偉

(昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明，650500)

茴香醚對雨生紅球藻(HaematococcuspluvialisLUGU)蝦青素積累和脂肪酸合成的影響

丁巍，尚敏敏，余旭亞，趙鵬，李濤，徐軍偉

(昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明，650500)

雨生紅球藻蝦青素積累過程與脂肪酸合成密切相關。實驗研究了添加不同質量濃度的茴香醚(butyl hydroxyanisole，BHA)對雨生紅球藻HaematococcuspluvialisLUGU，生物量濃度、蝦青素積累量以及脂肪酸合成的影響。結果顯示，在茴香醚質量濃度為2 mg/L，蝦青素積累量顯著提高，最大含量可達31.56 mg/g，比對照組(15.42 mg/g)提高到2.05倍，此時藻細胞內總脂肪酸的含量也達到最大值(12.27 %)，比同時刻對照組的含量(6.22 %)提高到1.97倍，單不飽和脂肪酸成分相比于對照組也產生了較大變化。脂肪酸合成關鍵基因acp、kas表達量也分別上調16.77、27.53倍。研究表明，適當濃度的BHA不僅能夠顯著提高蝦青素合成,而且影響了脂肪酸總量和組成。

茴香醚；雨生紅球藻；蝦青素；脂肪酸；脂肪酸合成基因

蝦青素由于具有超強的抗氧化能力和出色的著色能力，在水產養殖業、化妝品行業、保健食品行業和制藥行業已經被廣泛地運用[1-4]。雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種生存于淡水中的單細胞雙鞭毛綠藻，該藻細胞中蝦青素含量很高，約占細胞干重的1%～4%[5]。因此，雨生紅球藻成為獲取蝦青素的最佳來源。在脅迫條件下雨生紅球藻細胞會逐漸變大并積累蝦青素[6]，于是，使用誘導子作為脅迫條件誘導藻細胞更高效積累蝦青素，已是當前蝦青素生產和研究中的熱點。

利用不同性質的化學物質作為誘導子促進雨生紅球藻積累蝦青素發現，在適當濃度誘導子的誘導下，可以明顯的提高蝦青素積累量[7-9]。茴香醚(butyl hydroxyanisole，BHA)是一種化學合成抗氧化劑[10]，FRANZ等人[11]將其作為誘導子來提高次級代謝產物的積累，結果表明，微量的外源BHA能夠提高產油微藻細胞內油脂的產量。由此推測，BHA對雨生紅球藻中蝦青素的積累及脂肪酸的合成可能具有一定的影響。

在大多數高等植物代謝過程中，類胡蘿卜素類物質積累于葉綠體或者有色體的質體球滴結構中[12-13]，而雨生紅球藻合成的95%的蝦青素與脂肪酸發生甲酯化反應，儲存在富含有甘油三酯的脂囊泡中[14-15]。另一方面，藻類細胞通常會通過調節脂肪酸代謝通路進而改變細胞內脂肪酸組分及其百分含量來對脅迫環境做出應激反應[16]。acp,kas編碼脂肪酸生物合成途徑中最初的縮合反應，作為脂肪酸合成路徑上的關鍵基因，在脅迫條件下表達量會發生變化從而對脂肪酸合成產生影響。因此，研究脅迫條件下雨生紅球藻細胞積累蝦青素和脂肪酸合成及相關基因變化成為必要。

本課題以雨生紅球藻(HaematococcuspluvialisLUGU)作為研究對象，研究了不同濃度的BHA對雨生紅球藻細胞生長和蝦青素產量及BHA脅迫對脂肪酸合成及相關基因變化的影響，為蝦青素的生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻(HaematococcuspluvialisLUGU),由本實驗室篩選、保存。茴香醚(BHA)，TCI(上海)化成工業發展有限公司；DMSO，≥99.5%、 KOH，≥99.5%、甲醇(分析純)，北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

顯微鏡XS-212-202，JNOEC；超凈工作臺VS-840-1，上海博訊；冷凍干燥機FD5-12，SIM International Group；紫外可見分光光度計(Ultrospec 2100pro)，Amersham Biosciences；滅菌鍋LDZX-50KBS，上海申安；分析天平FA2004N，上海箐海；水浴鍋HHW-D6，金壇雙捷；離心機5804R，Eppendorf；高速冷凍離心機，1730R Labogene Scan speed；超聲波微波組合體系DS-8510DTH，上海生析。

1.3 實驗方法

1.3.1 雨生紅球藻的培養

以BBM(Bold’s Basal Medium)[17]為基礎培養基，取保藏于試管中的藻種，接種到3 L(內置2 L培養基)光生物反應器中，室內恒溫(25±1) ℃，光照強度2 800 lx，通入0.1 vvm的無菌空氣進行培養，直至培養到指數中期(12 d，約6.5×105cells/mL)。

1.3.2 茴香醚處理

將培養至指數中期的種子液于3 800×g離心5 min，用無菌水洗去營養鹽，然后把藻液沉淀重新懸浮到BBM缺氮培養基中，(接種量約為2×105cells/mL，培養基總體積為400 mL)。用DMSO(Dimethyl Sulfoxide)溶解BHA作為母液，將不同體積的BHA母液添加到缺氮的BBM培養基誘導培養，使誘導培養基中添加BHA質量濃度分別為0 mg/L對照、2 mg/L、4 mg/L和8 mg/L(保持DMSO加入量相等)，每組設3個平行樣。持續鼓入0.4 vvm的含1.5 % CO2的無菌空氣，24 h 8 000 lx光照，置于27±1℃室內培養15 d，以誘導藻細胞積累蝦青素。每隔1天取樣1次，測定HaematococcuspluvialisLUGU蝦青素含量和生物量。

1.3.3 蝦青素含量和生物量濃度的測定

準確稱取9.5 g蝦青素標準品(Sigma)，用甲醇-二氯甲烷(體積比3∶1)溶液配制成100 mg/L的儲備液(超聲波促進溶解)，存放于棕色瓶中，保存在4 ℃冰箱，使用前配成合適含量的工作液用于液相色譜分析。

取5 mL雨生紅球藻培養物于10 mL試管中，3 000 g低溫(4 ℃)離心15 min，棄去上清液，藻細胞沉淀用超純水洗3次，加入5 mL甲醇-二氯甲烷(體積比3∶1)提取液，在低溫環境下(試管外冰水冷卻)用高速組織勻漿機2 800 r/min勻漿20 s，勻漿液10 000 g低溫離心15 min，將上清液轉移至另一試管中。重復以上色素提取步驟3～4次，直至藻細胞中色素基本提取完全，細胞沉淀物變為灰白色為止。將所有收集的提取液10 000 g，再次低溫離心15 min，取上清液保存于-20 ℃，待用。

色譜柱為C18柱(waters, 25 cm×4.6 mm，5 mm)；流動相A為丙酮，流動相B為甲醇-水(9∶1)，洗脫梯度為：25 min B 80%～20%, 10 min 20% B, 5 min B 20%～80%, 流速為1.25 mL/min；檢測器為waters 996光電二極管陣列檢測器，進樣量為30 mL；光譜掃描波長范圍為250～700 nm，積分定量用檢測波長為476 nm,通過積分得到蝦青素質量濃度c(mg/L)。每隔1天定期取出50 mL處于誘導階段的藻液5 000 r/min離心10 min、-20 ℃冷凍、干燥、稱重，具體計算見式(1):

DBW=WA/V

式中，DBW，藻細胞生物量濃度， g/L；WA，藻粉干重，g；V，藻液體積，L。

進一步得出蝦青素含量：

P=c/DBW

式中，P，蝦青素含量，mg/g；c，蝦青素質量濃度。

1.3.4 脂肪酸組成的測定

將離心凍干后的微藻粉稱取5 mg，置于有墊片的密閉的玻璃中，依次加入0.2 mLV(氯仿)∶V(甲醇)(2∶1)，0.3 mL 35%的V(HCl)∶(甲醇)(1∶19)，將瓶口旋緊，置于85 ℃的水浴鍋內水浴加熱60 min；待取出冷卻至室溫后，將900 μL正己烷加入瓶內混勻，置于25 ℃，150 r/min 搖床內搖晃提取1 h，靜止后吸取上層正己烷萃取液，即完成脂肪酸甲酯化，轉移至GC-MS進樣瓶中待測脂肪酸組分。

利用Agilent 7890進行GC-MS 分析，色譜條件為：色譜柱為HP-5MS (5% Phenyl Methyl Silox, 30m×250μm×0.25 μm)，二階升溫程序為：170 ℃ 維持0 min， 每分鐘10 ℃的速度增加到190 ℃，維持1 min；再以每分鐘0.8 ℃ 的速度將溫度升高至 207 ℃，維持1 min；進樣量以分流比40∶1的標準，分流進樣1 μL；進樣口的溫度維持在250 ℃；高純氦氣(He)為載體，以每分鐘1.0 mL的流速流入；質譜條件：四級桿溫度為150 ℃，EI 離子源溫度為230 ℃，溶劑延遲2 min；質量掃描的范圍是50～550 amu。以NIST08.L作為數據庫，利用峰面積歸一化法進一步計算出脂肪酸各組分之間的相對百分含量。

1.3.5 蝦青素誘導過程中脂肪酸合成相關基因表達量的測定

本實驗由Primer 5.0軟件設計，上海生工生物工程技術服務有限公司合成acp、kas酶基因的上下游擴增引物(表1)。擴增所得序列測序(上海生工)后BLAST比對，并以此為模板設計熒光定量引物(表2)。

Trizol法提取不同濃度BHA處理的雨生紅球藻RNA，利用逆轉錄試劑盒(TaKaRa)將RNA逆轉錄合成cDNA，以其為模板，進行RT-PCR擴增，檢測不同濃度BHA對雨生紅球藻acp、kas基因表達的影響。通過ABI 7500熒光定量儀對acp、kas基因的表達進行定量，RT-PCR的數據結果用2-ΔΔCT的方法處理分析[18]。以18s(上游引物18sF：5’-CGGTCTGCCTCTGGTATG-3’，下游引物18sR： 5’-GCTTGCTTTGAACACGCT-3’)基因作為內標以調節RNA的用量和循環數，使內標基因在誘導條件下的表達豐度一致，最終得到基因表達量之間的倍數關系。

進行多元線性回歸分析(回歸方程中Y為蝦青素含量，X1，X2為acp、kas基因表達水平)，研究BHA誘導下雨生紅球藻脂肪酸合成和acp、kas基因表達量之間的相關性。

表1 酶基因克隆引物表

表2 酶基因熒光定量引物

1.3.6 數據處理

本文全部試驗均設置3組平行，利用ANOVA(SPSS19.0)一步法分析實驗數據。最小顯著性差異進行多重比較檢驗調查不同試驗的組間差異，且當P<0.05具有顯著性意義。

2 結果與分析

2.1 BHA對誘導培養微藻細胞生長的影響

由圖1可知，將不同濃度的BHA分別添加至培養基中，在培養15 d的過程中，對照組藻細胞的生長符合一般生長趨勢，即在第0～7天時，藻細胞生長緩慢，之后呈對數生長趨勢快速生長，在第11天進入穩定期，第13天達到最大值(0.71 g/L)之后藻細胞生物量濃度開始快速下降。相比之下，茴香醚處理的實驗組的生長和分裂受到抑制，四組實驗組中藻細胞的生物量濃度均低于對照組生物量。此外，隨著茴香醚濃度的增高，最大生物量質量濃度逐漸降低1 mg/L BHA處理下，生物量濃度為0.54 g/L，2 mg/L BHA處理下，生物量濃度為0.52 g/L，4 mg/L BHA處理時為0.46 g/L，而當BHA濃度增加到8 mg/L時生物量濃度僅為 0.45 g/L。由此可見藻細胞在誘導階段，誘導劑BHA的添加不利于藻細胞的生長，使藻細胞的生長量降低。這種現象與之前文獻中發現的抗氧化劑不利于藻細胞生長相同[19]。

圖1 不同質量濃度茴香醚對雨生紅球藻生長的影響Fig.1 Effect of BHA on biomass of H. pluvialis during induction days

2.2 BHA對誘導培養微藻細胞蝦青素積累的影響

圖2 不同質量濃度茴香醚對雨生紅球藻蝦青素含量的影響Fig.2 Effect of BHA on astaxanthin content of H. pluvialis during induction days

從圖2中可以看出，用不同質量濃度BHA誘導微藻細胞，蝦青素積累量未表現出良好的劑量效應，實驗組中微藻蝦青素積累量最大值隨BHA濃度的增加先增加后逐漸降低，但相對于對照組呈現明顯的提高。在2 mg/L茴香醚處理下，蝦青素含量在13天時達到了最大值31.56 mg/g，比對照組(15.42 mg/g)增加2.05倍。雖然1、4 mg/L BHA處理組蝦青素積累量相對于對照組表現出了促進作用，但相比2 mg/L BHA處理組還是相對較低，對蝦青素積累的促進作用不太明顯。8 mg/L BHA處理組在3天后積累量甚至低于對照組，這種情況一直持續到了誘導的第11天，之后開始增長在第13天才高于對照組。蝦青素產量也得到了相同的結果(圖3)，在培養前期蝦青素產量增加緩慢，2 mg/L BHA處理組在第七天開始急劇增加，在15天達到了最大值顯著高于對照組。因此，藻細胞在誘導階段， BHA雖然抑制了微藻細胞的生長卻有利于蝦青素的積累，用合適濃度BHA誘導可以較大幅度提高蝦青素的積累量。

圖3 不同質量濃度茴香醚對雨生紅球藻蝦青素產量的影響Fig.3 Effect of BHA on astaxanthin production of H. pluvialis during induction days

2.3 BHA對藻細胞內脂肪酸組成的影響

對2 mg/L BHA 實驗組和對照組藻細胞內脂肪酸的含量及組分進行分析測定，得到表 3、表 4。總體上，脂肪酸的含量在第13天最高，而由2.2中可知，此時蝦青素產量也達到最大值。這種結果的原因可能是因為脂肪酸大量合成促使蝦青素轉化成蝦青素酯進一步儲存，而蝦青素酯的合成需要大量的脂肪酸，因此脂肪酸與蝦青素在同一時間達到最大值。然而，當蝦青素產量下降時，過多的脂肪酸產生產物抑制效應，脂肪酸含量也會進一步降低[20]。雖然對照組與實驗組的飽和脂肪酸含量最后相差無幾，但對照組的飽和脂肪酸含量在第5天時大幅增加，達到最大值64.52%，而實驗組中并未發現飽和脂肪酸。然而單不飽和脂肪酸的情況卻截然相反：第5天時實驗組單不飽和脂肪酸含量高達49.68%，但在對照組中卻未檢測到單不飽和脂肪酸的存在。這表明用BHA誘導雨生紅球藻積累蝦青素時，脂肪酸總量雖然沒多大變化但對脂肪酸組成產生了較大影響。

表3 實驗組藻細胞內脂肪酸含量及成分的變化

表4 對照組藻細胞內脂肪酸成分及含量的變化

續表4

脂肪酸/%總脂肪酸/%第1天第3天第5天第7天第9天第11天第13天第15天C16∶028.43±0.431.85±0.364.52±0.2**1.17±0.03**27.35±0.328.71±0.528.97±0.224.34±0.3C16∶3Nd0.67±0.01Nd1.30±0.050.95±0.02NdNdNdC16∶44.53±0.022.53±0.03Nd3.28±0.12.73±0.032.94±0.43.28±0.023.39±0.04C17∶1NdNdNdNdNdNd5.44±0.5NdC17∶4NdNdNdNd0.86±0.1NdNdNdC18∶0NdNdNd5.49±0.45.50±0.4*NdNd1.18±0.1C18∶14.73±0.01*41.03±0.4*Nd33.15±0.135.19±0.96.07±0.338.00±0.35.18±0.02C18∶215.17±0.0322.02±0.3Nd1.48±0.5**23.97±0.423.58±0.123.19±0.424.22±0.3C18∶327.65±0.2Nd35.48±0.322.50±0.3Nd36.92±0.41.12±0.1**36.00±0.9C18∶4Nd1.17±0.229.71±1.6**Nd1.38±0.5NdNd1.81±0.4C20∶3NdNdNdNdNd0.99±0.01NdNdC22∶118.00±0.04**NdNdNdNdNdNdNd飽和脂肪酸/%b28.43±0.232.58±0.364.52±1.9**7.31±0.9**32.85±1.729.49±1.328.97±1.626.81±1.9單不飽和脂肪酸/%c22.73±0.541.03±1.5Nd33.15±1.435.86±1.36.07±0.543.44±2.7*5.18±1.1*多不飽和脂肪酸/%d48.86±1.326.39±1.465.19±1.228.56±1.929.89±1.164.43±1.227.59±1.565.42±1.4*%脂肪酸/%DCW(w/w)6.20±0.0210.82±0.10.66±0.01**9.98±0.0112.96±0.02*10.31±0.016.22±0.019.44±0.01

2.4 茴香醚對藻細胞內脂肪酸合成基因的影響

圖4 茴香醚對脂肪酸合成相關酶基因表達量的影響Fig.4 Effects of BHA on the transcript levels expression kinetics of seven astaxanthin biosynthetic genes in H. pluvialis during induction days

圖4表明，茴香醚誘導蝦青素積累過程中，脂肪酸合成相關的關鍵基因的表達量有很明顯的變化。acp、kas作為脂肪酸合成的關鍵基因，與對照組比2者表現出較高水平的表達，總體上，表達量表現出不同程度的上調。其中，誘導第7天蝦青素大量累積，并伴隨著飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸，特別是油酸的含量的巨大變化，而這些成分的變化也伴隨著脂肪酸酶基因表達量的波動。C18∶1含量增加33.15倍而C16∶0含量下降63.35%，而此時acp、kas表達量分別上調16.77、27.53倍。因此，這種結果進一步表明BHA可以改變脂肪酸合成基因的表達從而影響蝦青素的積累，這也將有利于在添加BHA條件下雨生紅球藻細胞中蝦青素的積累。

BHA誘導H.pluvialisLUGU脂肪酸合成和acp、kas基因表達量之間的相關性表明，當acp、kas表達水平低時，微藻蝦青素含量隨其后表現出低含量；如acp、kas表達水平提高，蝦青素的含量隨之增加，兩者呈現線性相關，回歸方程為：y=4.755X1-2.829X2+4.894，R2=0.985(式中，y為H.pluvialisLUGU蝦青素含量；X1，X2為acp、kas基因的表達水平；R2直線方程的相關系數)。

3 討論

近年來抗氧化劑逐漸被許多研究者用作誘導子來提高生物體內次生代謝產物，如在培養過程中加入1.48μmol/L沒食子酸來誘導微藻細胞中油脂的積累，微藻Nannochloropsissalina油脂濃度可以增加 217 %[11]。這表明抗氧化劑可以明顯的提高次級產物的積累。LU等[7]利用不同的植物激素作為誘導子來促進雨生紅球藻積累蝦青素發現，將不同濃度的茉莉酸甲酯(MJ)、赤霉素 (A3) 作為誘導子分別加入處于生長對數期的藻液中，置于高光照、缺氮等誘導條件下誘導微藻積累蝦青素，結果表明，20 mg/ L茉莉酸甲酯和赤霉素(A3)大大提高了微藻蝦青素積累量，有效促進雨生紅球藻蝦青素的合成，但低濃度的誘導劑對微藻細胞蝦青素積累促進作用較弱。可見只有在適當濃度誘導子的誘導下，蝦青素積累量才能得到明顯的提高。GAO等[9]利用乙烯利作為誘導子，在質量濃度為0.05 mL/L處理組蝦青素積累量最高，而高質量濃度(≥0.15 mL/L)乙烯利對雨生紅球藻細胞有強烈的致死作用。這說明植物激素對于微藻細胞也具有雙重性，即只有合適的濃度才能發揮其生物學作用，過低時不起作用，過高時產生抑制甚至毒害作用。茴香醚作為一種化學合成的抗氧化劑[10]，能夠鰲合金屬離子、清除自由基、淬滅單線態氧、清除氧、抑制氧化酶活性等。有研究表明[21]，BHA質量濃度達到 16 mg/L時斜生柵藻幾乎完全受到抑制，隨著暴露時間的延長，細胞生長受抑制越來越明顯，生長越來越緩慢。但在BHA質量濃度小于 8 mg/L 時，斜生柵藻 48 h 細胞的抑制率反而比 24 h 降低，這說明較低質量濃度的 BHA 暴露在短時間內不會對斜生柵藻的生長產生嚴重影響，甚至藻類可產生一定的適應性，受抑制程度減弱。在用1、2、4、8 mg/L BHA 誘導雨生紅球藻積累蝦青素過程中，也得到相似的結論。添加外源BHA可刺激植物防御基因的表達，誘導植物的生理防御，促使防御相關化合物的合成。蝦青素是雨生紅球藻在脅迫條件下積累的次級代謝產物，因此研究BHA對雨生紅球藻的生長以及蝦青素積累的影響有廣闊的應用前景。在本實驗中，微藻在積累蝦青素的過程中也同樣具有相同的結果。BHA與沒食子酸類似，也促進了次級代謝產物的積累，在一定程度上提高了蝦青素的積累量，另一方面，也和植物激素一樣表現出了劑量效應。

油酸(18∶1)是單不飽和脂肪酸的主要成分，并有研究表明油酸是厚囊孢子中與蝦青素聯系最為緊密的脂肪酸組分[15]。ZHEKISHEVA[22]等人也發現，油脂是在脅迫環境下與蝦青素酯的合成最為相關的組分。acp、kas在脂肪酸合成途徑中起著關鍵的調節作用[20]，本實驗結果也顯示，實驗組油酸的含量比對照組中高，然而當第5天時油酸含量呈微量，這可能由于在誘導培養第5天時，油酸被大量利用和蝦青素發生酯化反應合成蝦青素酯，因此油酸的含量很少。之后，油酸的缺乏作為一種信號反饋刺激油酸在接下來時間內大量合成，另一方面，BHA作為抗氧化劑可以減少脂肪酸的氧化，從而提高蝦青素的積累。隨著飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪酸的含量不斷變化，蝦青素積累也不斷變化，證明了誘導過程中脂肪酸合成和組分變化會影響蝦青素的積累。

4 結論

適宜濃度的BHA有利于促進雨生紅球藻H.pluvialisLUGU細胞蝦青素的積累和脂肪酸的合成。添加濃度為2 mg/L BHA，微藻細胞蝦青素積累量達到最大31.56 mg/g，比對照組提高到2.05倍；通過不同脂肪酸組分的含量變化及關鍵基因acp、kas表達量分析，結果表明誘導條件下acp、kas基因上調促進了脂肪酸的合成進而增加蝦青素酯的合成，提高蝦青素的積累。

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Effects of butyl hydroxyanisole on astaxanthin accumulation and the fatty acid biosynthesis ofHaematococcuspluvialisLUGU

DING Wei, SHANG Min-min, YU Xu-ya, ZHAO Peng, LI Tao, XU Jun-wei*

(Faculty of Life Sciences and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)

The accumulation ofHaematococcuspluvialiscompound astaxanthin is correlated with fatty acid pathway. In this paper, different concentration of Butyl hydroxyanisole (BHA) were studied for their effect on the production of astaxanthin inHaematococcuspluvialisLUGU under unfavorable condition. The results showed that 2 mg/L BHA was optimal for astaxanthin production, which reached 31.56 mg/g and was 2.05 times of the control (15.42 mg/g). Moreover, the content of total fatty acids in algal cells also reached maximum level (12.27%), which was 1.97 times of that of the control (6.22%) and the components of monounsaturated fatty acid also changed significantly. The transcription levels ofacp,kasgenes which was important for fatty acid synthesis were up-regulated 16.77 and 27.53 fold, respectively. The results demonstrated that appropriate concentration of BHA couldnot only improve astaxanthin synthesis, but also affect the micro algae amount and composition of fatty acids.

butyl hydroxyanisole (BHA);HaematococcuspluvialisLUGU; astaxanthin; fatty acids; fatty acid synthesis genes

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702005

碩士研究生(徐軍偉副教授為通訊作者，E-mail:xjuwei@163.com)。

國家自然科學基金資助項目(21266013)

2016-07-03，改回日期：2016-11-03