細菌纖維素管的發酵條件優化及結構性能研究

湯衛華，賈士儒

1(天津現代職業技術學院 生物工程學院，天津，300350) 2(天津市工業微生物重點實驗室，天津，300457)

細菌纖維素管的發酵條件優化及結構性能研究

湯衛華1，賈士儒2*

1(天津現代職業技術學院 生物工程學院，天津，300350) 2(天津市工業微生物重點實驗室，天津，300457)

木醋桿菌是一種革蘭氏陰性專性需氧菌，采用透氣管材硅膠管作為發酵容器生產細菌纖維素(Bacterial Cellulose, BC)管，實驗中考察發酵培養基種類、發酵時間、接種量對BC管產量的影響。結果表明，最適發酵時間為6 d，發酵培養基為復合培養基，最適接種量為4 %(v/v)。采用FTIR、XRD對BC管的結構性能進行表征，結果發現BC管的結晶度稍低于BC膜，BC管的拉伸性能達到50.25 MPa，與BC膜相當。采用原子力顯微鏡(AFM)觀察BC管的微觀形貌，發現BC管是由纖維束高度纏繞而形成，與BC膜相比，BC管的纖維束大小相差較大，這也可能是造成BC管在結晶度和拉伸性能上稍低于BC膜的原因。該研究可為BC管在高附加值的食品包裝材料、組織工程支架材料等的應用提供基礎數據。

細菌纖維素管；發酵條件；優化；性能表征

細菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是某些細菌合成的高分子化合物，具有超精細網狀結構，雖然BC和植物或海藻產生的纖維素具有相同的分子結構單元，但BC卻具有很多獨特的性質如高結晶度、高化學純度、高抗張強度、高彈性模量、高持水性、良好的生物相容性、生物合成的可調控性等[1-2]，這些性質是其他來源的纖維無法比擬的。

基于BC生物合成具有可調控性，很多研究者探索不同發酵技術和方法合成管狀BC，如BODIN[3]等人采用2種不同的發酵技術合成BC管，并探討其作為組織工程支架血管的潛力；KLEMM[4]采用圓柱形玻璃基 (cylindrical glass matrix)作為發酵容器， BC管在玻璃基間隙形成。管狀細菌纖維素的出現，不僅可以豐富細菌纖維素的品種，同時可以拓展細菌纖維素的應用領域。管狀細菌纖維素將在高附加值食品包裝和組織工程支架材料如人造血管和人工食管等上具有應用潛力。

作者在前期也進行了大量的BC管的研究，比較2種發酵細菌纖維素管的模式，從發酵效率等方面確定發酵模式2為生產BC管的最適方法[5]。在此基礎上，本研究對BC管的發酵條件進行優化，同時對BC管性能進行的表征，以期全面把握BC管的性能，有利于其推廣應用。

1 材料與方法

1.1 菌種和主要的材料

木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacteroboediens)，工業微生物教育部重點實驗室保藏。硅膠管(Φ9 mm×6 mm、Φ16 mm×12 mm、Φ20 mm×16 mm、Φ25 mm×20 mm、Φ31 mm×25 mm)：市售。

1.2 培養基

細菌纖維素合成培養基是在SON等人[6]優化的合成培養基上進行修改的，培養基組成(g/L)：葡萄糖 25，(NH4)2SO410， Na2HPO43.5， KH2PO41，MgSO4·7H2O 1.0， FeSO4·7H2O 0.015，煙酸 0.003，生物素 0.02，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

細菌纖維素復合培養基組成(g/L): 葡萄糖 25，酵母粉 7.5，蛋白胨 10，Na2HPO410，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 BC管和BC膜的制備

1.3.1 BC 管的制備

在滅過菌的硅膠管中倒滿發酵培養基，以6%(v/v)的比例接入種子培養基，然后用膠塞將管材兩端密封。在30 ℃下靜置培養6 d。培養結束后，將細菌纖維素管從管材中取出[5]。

1.3.2 BC膜的制備

以6%(v/v)的接種量接入液體培養基(500 mL的錐形瓶盛有100 mL液體培養基)，接種時需充分振蕩，以使菌液均勻，30 ℃恒溫靜置培養6 d。

1.4 細菌纖維管提取和處理方法

培養結束后，從硅膠管內BC管取出，用水多次沖洗，除去管表面培養基及雜質。再將管浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液中，100 ℃煮沸20 min，去除液管中的菌體和殘留培養基，管呈乳白色半透明。然后用蒸餾水多次沖洗，用pH試紙輕壓膜測pH值，約7.2。80 ℃干燥至恒重，進行稱重。

1.5 原子力顯微鏡(AFM)

BC膜和BC管的表面形貌采用原子力顯微鏡((JSPM-5200, Japan)觀察。掃描模式為輕敲模式，通過自動平滑和低通濾波處理消除慢掃的低頻噪音。

1.6 紅外光譜(FTIR)

采用傅立葉變換紅外光譜儀VECTOR 22來進行，波長掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.7 X-射線衍射(XRD)

采用X-射線衍射儀(X-ray diffractometer)，Rigaku(日本理學株式會社)，D/max-250。將BC膜和BC管平整固定在框架上，Cu靶，10 kV高壓，管流100 mA，進行2θ=5～40°大范圍掃描。結晶度(C.I)的計算公式(1)計算[7]：

式中：I020，晶格衍射的最高強度值;Iam是2θ=18°的強度值。

1.8 拉伸性能

用微機控制電子萬能試驗機(RG-5)來測定BC膜的拉伸強度和斷裂伸長率，首先截取長度為10 cm、寬度為1 cm的BC，速度為5 mm/s，當BC片拉伸后開始記錄為零應力。使用CH-1-SST型塑料薄膜薄片測厚儀測定BC膜的厚度。拉伸強度公式(2)計算：

(2)

2 結果與討論

2.1 BC管發酵條件的優化

2.1.1 不同的發酵培養基對BC管生物合成的影響

考察復合培養基和合成培養基對BC管生物合成的影響，采用硅膠管(Φ16 mm×12 mm)為發酵容器，以6 %(v/v)的接種量接入培養基中，在30 ℃下培養6 d。結果如表1所示。

表1的結果表明，復合培養基中形成的BC管產量及厚度均高于合成培養基。這可能是木葡糖酸醋桿菌在復合培養基中生長較好，而木葡糖酸醋桿菌的生長與細菌纖維素的產量相偶聯。因此在復合培養基中合成的BC管厚度和產量高于合成培養基中。

表1 不同的發酵培養基對合成BC管的影響

2.1.2 不同培養時間對BC管生物合成的影響

采用硅膠管(Φ20 mm×16 mm)為發酵容器，以6 %(v/v)的接種量接入培養基中，在30 ℃條件下培養，考察不同的培養時間1、2、4、6、8 d對BC管生物合成的影響，結果如表2所示。

表2 不同的培養時間對BC管生物合成的影響

表2的結果表明，木葡糖酸醋桿菌在培養的第6天生物合成的細菌纖維素管產量最高，同時菌體量也達到最高值。確定生物合成BC管的時間為6 d。

2.1.3 接種量對BC管生物合成的影響

采用硅膠管(Φ20 mm×16 mm)為發酵容器。接種量分別為2 %、4 %、6 %、8 %(v/v)。在30 ℃下培養6 d，結果如圖1所示。

圖1 接種量對BC管生物合成的影響Fig.1 Effect of inoculums volume on BC tubes

圖1的結果表明，接種量對木葡糖酸醋桿菌合成細菌纖維素管的產量影響不大，其中接種量為4 %～8 %(v/v) 區間，BC產量非常接近，綜合考慮， BC管的生物合成的最適接種量為4 %(v/v)。

2.1.4 不同管徑BC管的生物合成

采用不同管內徑(Φ9 mm×6 mm、Φ16 mm×12 mm、Φ20 mm×16 mm、Φ25 mm×20 mm、Φ31 mm×25 mm)的硅膠管作為發酵容器，在優化條件下(接種量4 %、復合培養基和發酵時間6 d)生物合成BC管，結果如圖2所示。

(a)管內徑為6、12、16、20、25 mm的BC管的橫切面(b)管內徑為25 mm的BC管全貌圖2 不同管徑BC管的生物合成Fig.2 Digital images of BC tubes with different diameters

由圖2可知，在優化的發酵條件下，不同的管徑中均能形成BC管，具體看的BC管橫切面圖，如圖2(a)。同時也可以看到形成的BC管是均勻的，見圖2 (b)。這說明，采用硅膠管作為發酵容器，在接種量4 %(v/v)、復合培養基和發酵時間6 d的條件下，在不同的管徑中均能合成均勻的BC管。

2.2 BC管的結構性能

2.2.1 紅外光譜(FTIR)

由BC管的紅外光譜譜圖可知(圖3)，位于1 060 cm-1為C—O—C和C—O—H鍵的伸縮振動引起的，是纖維素的特征吸收峰；在3 350 cm-1處的吸收峰，反映了O—H鍵的伸縮振動；2 895 cm-1處的吸收峰則是由O—H鍵的伸縮振動產生的；在1 428 cm-1處的吸收峰是由C—H鍵彎曲振動引起的，深度與纖維素結晶度有關；在1 200～1 500 cm-1之間出現多個吸收峰，主要是—CH，—CH2以及OH的彎曲與搖擺振動引起的。在897 cm-1的吸收峰是糖苷鍵的特征峰。SUGIYAMA[8]等認為在600～800 cm-1區域之間的吸收峰，由于存在很多重疊以及不同峰之間的極化現象，造成該區域的吸收峰不明確，因此通常很難解釋。

圖3 BC管的FTIR譜圖Fig.3 FTIR spectra of BC tube

2.2.2 X-射線衍射(XRD)

纖維素X-射線衍射圖譜是以衍射角為橫坐標，衍射強度為縱坐標，以晶胞(1-10)，(110)和(020)面的衍射峰為計算基準，其他位置的衍射峰與結晶度計算關系不大[9]。圖4中BC管和BC膜是典型的細菌纖維素XRD圖譜，沒有明確的結晶銳衍射和非晶漫散射之分，有的只是介乎它們之間的寬化衍射峰。說明在細菌纖維素中不存在單一的、明確的結晶相和非晶相，而是在晶態和非晶態之間存在一種整體的有序度變化。同時從XRD譜圖發現BC膜和BC管具有極其相似的衍射峰分布，BC膜的3個主要衍射峰位于14.580、16.800和22.620，BC管的3個主要衍射峰位于14.460、16.520和22.680，分別對應于晶面(1-1 0)， (1 1 0)和 (0 2 0)，如圖4所示，這與前人的結論非常相似[10-12]。

圖4 BC管和BC膜的XRD譜圖Fig.4 XRD patterns of BC tube and BC membrane

樣品結晶度/%2θ(d(1,-1,0))2θ(d(110))2θ(d(020))BC膜83.914.580(6.07)16.800(0.282)22.620(0.941)BC管82.614.460(6.12)16.520(5.36)22.680(3.91)

由表3可知，BC管和BC膜均有較高的結晶度，分別為82.6 %和83.9 %，BC膜的結晶度稍高于BC管。 這說明BC管在結晶度上已達到普通BC膜的水平。

2.2.3 BC管的微觀形貌

BC管的微觀形貌與在相同條件下制備的BC膜相比較，結果如圖5所示。

(a)BC管(50 000×); (b) BC膜(50 000×)圖5 BC管和BC膜的微觀形貌圖Fig.5 Graphs of BC tube and BC membrane

由圖5(a)可知，BC管通過纖維束相互纏繞而形成，其表面較為致密。與BC膜相比，BC管的表面致密度和均勻度均低于BC膜，同時BC管的纖維束粗細相差很大，而BC膜的纖維束粗細比較均勻，見圖5(a)和(b)。這可能是BC管和BC膜結構性能存在一些差異的原因。

2.2.4 拉伸性能

采用微機控制電子萬能試驗機測定BC膜和BC管的拉伸強度，結果見圖6。

圖6 BC管與BC膜的拉伸性能Fig.6 Tensile strength of bacterial cellulose tube and bacterial cellulose membrane

在相同發酵條件(接種量4 %、復合培養基和發酵時間6 d)下，制備得到的BC管和BC膜拉伸強度相當，BC管的拉伸強度達到50.25 MPa。這說明BC管也具有良好的拉伸性能。

3 結論

采用硅膠管作為發酵容器培養木醋桿菌生產細菌纖維素管，其最適發酵條件時是發酵時間為6 d，發酵培養基為復合培養基，接種量為4 %(v/v)。采用FTIR、XRD和微機控制電子萬能試驗機對BC管的結構性能進行表征，發現BC管具有纖維素的特征峰，結晶度達到82.6%，拉伸強度為50.25 Mpa。采用AFM對 BC管的微觀形貌進行觀察， BC管是由纖維束高度纏繞而形成，構成BC管的纖維束尺寸差異較大，而BC膜的較為均勻，其原因有待進一步研究。

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Optimization of fermentation conditions for bacterial cellulose tube and study on its structure performance

TANG Wei-hua1, JIA Shi-ru2*

1(Department of Chemical Biology, Tianjin Modern Vocational Technology College, Tianjin 300350, China)2(Key Laboratory of Tianjin Industrial Microbiology, Tianjin 300457, China)

Acetobacterxylinumare γ-negative, aerobic, rod-shaped bacteria. Bacterial cellulose (BC) tube was produced by fermentingAcetobacterxylinumon inner surface of oxygen-permeable silicone tube. The effects of culture medium, fermentation time, and inoculum on the yield of BC tube were studied. The culture medium was complex culture.The maximum BC tube concentration was achieved after culture with 4 %(v/v) inoculums for 6 days. The bacterial cellulose tube was characterized by FTIR and XRD. The crystallinity index of the BC tubes was 82.6 %, which was slightly lower than the value of BC membrane. Tensile strengths of BC tubes were 50.25 MPa, which was close to the value of BC membrane. The morphology of the tubes was characterized by Atomic Force Microscope (AFM).Results revealed that BC tube was synthesized in the form of microfibrils creating highly entangled network of micro-and nanofibers.Compared with BC membrane, microfibrils of BC tubes had significant differences in geometrical dimensions. This may be able to explain why the crystallinity and tensile properties of BC tube were slightly lower than BC membrane. The experiment results can provide basic data for the application of BC tube on high value-added food packaging materials and tissue engineering scaffolds.

bacterial cellulose tube; fermentation condition; optimization; structure performance

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702007

博士研究生，教授(賈士儒教授為通訊作者)。

國家自然科學基金(21106105)

2016-07-28，改回日期：2016-10-08