大豆低聚肽中抗氧化肽的分離純化及結構鑒定

劉文穎，谷瑞增，魯軍，潘興昌，蔡木易

(中國食品發酵工業研究院，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京，100015)

大豆低聚肽中抗氧化肽的分離純化及結構鑒定

劉文穎，谷瑞增，魯軍，潘興昌，蔡木易*

(中國食品發酵工業研究院，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京，100015)

為考察大豆低聚肽中抗氧化肽的活性和結構，以大豆分離蛋白為原料，采用兩步酶解法制備出大豆低聚肽，在對其理化成分進行分析的基礎上，以DPPH自由基清除能力為指標對其抗氧化活性進行了評價。結果表明：大豆低聚肽的DPPH自由基清除活性的IC50值約為2.6 mg/mL。利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對大豆低聚肽進行分離純化，收集6個組分峰，對其DPPH自由基清除能力進行了測定。結果表明，6個組分的活性均比大豆低聚肽高。最后利用Q-TOF質譜儀對活性最高的組分5#進行了結構鑒定，并對鑒定出的6個肽段的DPPH自由基清除活性進行了評價。結果表明，6個肽段均有一定的DPPH自由基清除能力，其中Leu-Tyr(LY)、Leu-Ala-Gly-Arg(LAGR)、Phe-Ser-Arg(FSR)的清除率比大豆低聚肽高，是具有較高抗氧化活性的肽段。

大豆低聚肽；抗氧化肽；分離純化；結構鑒定

自由基會引起DNA損傷和細胞損傷，導致多種疾病和衰老的發生[1]。抗氧化劑能夠清除體內多余的自由基，維持體內自由基的平衡，從而增強機體免疫力，延緩衰老。目前由于人工合成抗氧化劑如叔丁基-羥基-茴香醚(BHA)、丁羥基-甲苯(BHT)、特丁基對苯二酚(TBHQ)等存在潛在的危害，尋找天然安全的抗氧化劑成為研究的熱點[2]。天然抗氧化肽因具有較強抗氧化活性和很高的安全性，在食品等領域展現出極好的應用前景。

大豆低聚肽是大豆蛋白經過酶解后得到的短肽混合物，分子質量大多在1 000 u以下，氨基酸組成與大豆蛋白基本相同，還具有大豆蛋白所不具備的良好的溶解性、穩定性等理化性質[3-4]。大豆低聚肽具有抗氧化、降血壓、降血糖、降膽固醇、抗疲勞等多種生理功能，其中抗氧化性是大豆低聚肽其他生理活性的基礎[5]。目前，國內外關于大豆肽抗氧化性的研究報道較多，然而，關于大豆低聚肽的分離純化及其結構與活性的關系缺少深入和系統的研究。本研究以大豆分離蛋白為原料，通過生物酶解法制備大豆低聚肽，同時對大豆低聚肽中的抗氧化肽段進行分離純化和結構鑒定，研究大豆低聚肽中抗氧化肽的活性及其結構，為大豆低聚肽的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料

大豆分離蛋白，實驗室堿提酸沉法制得；堿性蛋白酶(2.4 AU/g)和中性蛋白酶(2.4 AU/g)，諾維信生物技術有限公司；乙腈(色譜純)，美國Fisher公司；三氟乙酸(分析純)，英國Alfa Aesar公司；2, 2-二苯基-1-苦味肼基自由基(DPPH)(色譜純)，美國Sigma公司。

1.2 主要儀器設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋，普瑞斯機械有限公司；YG30噴霧干燥機，無錫市陽光干燥設備廠；Spectra MR酶標儀，美國DYNEX公司；LC-20AD型高效液相色譜儀、FRC-10A收集器，日本SHIMADZU公司；XBridge BEH130 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，美國Waters公司；TSK gel G2000 SWXL凝膠過濾柱(7.8 mm×300 mm)，日本TOSOH公司；Q-TOF2正交加速電噴霧串聯質譜儀，英國Micromass公司；model 90多肽合成儀，美國AAPPTec公司；Voyager DE-Pro MALDI-TOF-MS質譜儀，美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆低聚肽的制備

采用本中心前期優化好的制備工藝[3]。將80 g大豆分離蛋白溶于1 000 mL蒸餾水中，混合均勻。90 ℃水浴10 min后，降溫至55 ℃，調節蛋白溶液的pH值至8.5，以每克蛋白質2 500單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解2 h。調節pH值為7.0，降溫至50 ℃，以每克蛋白質3 000單位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h。在水浴鍋中100 ℃滅酶15 min。冷卻至室溫后，利用離心機離心30 min，10 000×g。取上清液，用截留分子質量為1 000 u的超濾膜超濾，得到分子質量小于1 000 u的濾過液，利用噴霧干燥器進行噴霧干燥，得到大豆低聚肽干粉20 g(得率為25%)。

1.3.2 基礎理化成分測定

蛋白質含量測定參照GB 5009.5；脂肪含量測定參照GB/T 5009.6；水分含量測定參照GB 5009.3；灰分含量測定參照GB 5009.4[6-9]。

1.3.3 體外抗氧化活性測定

以清除DPPH自由基能力為指標，采用酶標儀法進行測定。在96孔酶標板中加入樣品溶液100 μL和0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液100 μL。振蕩30 s后，避光反應30 min，于517 nm下測定吸光度AS，同時測定100 μL 0.1 mmol/L DPPH溶液與100 μL乙醇混合液的吸光度AC，以及100 μL樣品溶液與100 μL乙醇混合液的吸光度AB。計算公式為：

(1)

1.3.4 RP-HPLC分離大豆低聚肽

大豆低聚肽采用分析型C18色譜柱進行RP-HPLC分離。色譜條件為：流動相A為水(含體積分數為0.1%的三氟乙酸)，流動相B為體積分數為80%的乙腈(含體積分數為0.1%的三氟乙酸)；梯度洗脫程序：0～50 min，流動相B：0%～15%；50～120 min，流動相B：15%～40%；120～140 min，流動相B：40%～80%；樣品質量濃度：10 mg/mL；檢測波長：UV 220 nm；流速：0.6 mL/min；進樣體積：100 μL。分管收集主要的組分峰，利用氮吹儀除去收集液中的三氟乙酸、乙腈等有機溶劑，冷凍干燥備用[11]。

1.3.4 Q-TOF MS測定分子質量及肽序列

采用Q-TOF2正交加速電噴霧串聯質譜儀進行結構鑒定，質譜條件為：離子化方式：納升電噴霧正離子；霧化氣體：N2；碰撞氣體：Ar；源溫：80 ℃；錐孔電壓：50 V；TOF加速電壓：9.1 kV；MCP檢測器電壓：2 150 V；毛細管電壓：800 V；MS和MS/MS的質量準確度：0.1 u[11]。

1.3.5 肽段合成方法

肽段合成由北京中科亞光生物科技有限公司進行。采用多肽固相合成法(Fmoc方法)，利用多肽合成儀合成粗肽。然后利用分析型HPLC對粗肽進行檢測，純度為60%左右。用水將粗肽溶解，利用制備型HPLC進行純化，凍干得到純品，再用分析型HPLC進行檢測，純度為98%以上，利用質譜儀進行檢測，保證分子質量正確。

1.3.6 數據統計分析

每組實驗重復3次，采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行處理，所有圖中誤差值采用SD值。

2 結果與討論

2.1 大豆低聚肽的基礎理化成分

大豆低聚肽中蛋白質含量為(88.69±4.32)%，脂肪含量為(0.05±0.01)%，水分含量為(4.96±0.59)%，灰分含量為(5.23±0.68)%。這表明大豆低聚肽中蛋白質含量較高，而其他成分含量較少，可作為一種優質的蛋白質原料。因此，以大豆分離蛋白為原料，通過復合酶解法可以有效獲得大豆低聚肽產品。

2.2 大豆低聚肽的體外抗氧化作用

以DPPH自由基清除能力為指標評價大豆低聚肽的體外抗氧化作用。DPPH自由基是一種穩定的自由基，其乙醇溶液顯紫色，在517 nm處有最大吸收[12]。DPPH法是評價抗氧化物的自由基清除能力的常用方法，能比較全面地評價抗氧化活性[13]。當有供氫能力的抗氧化劑存在時(如酚類)，DPPH自由基溶液的顏色變淺，吸光度值變小，根據吸光度的變化可測得抗氧化劑的活性。

大豆低聚肽的DPPH自由基清除能力如圖1所示。

圖1 大豆低聚肽對DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effects of SOP on DPPH radical

在實驗濃度內，大豆低聚肽對DPPH自由基清除率隨濃度的增大而不斷增強。在高濃度時，清除率上升趨勢減緩，這可能是由于低聚肽已經趨于飽和的原因。濃度15 mg/mL時，大豆低聚肽的清除率為(90.10±3.79)%，半抑制濃度(IC50值)約為2.6 mg/mL。說明大豆低聚肽具有供氫能力，從而起到清除DPPH自由基的作用。大豆低聚肽的供氫能力與其氨基酸組成有關，具有質子供體特性的氨基酸殘基是其抗氧化活性的必要組成，能夠將氫原子給予自由基，阻斷或減弱自由基反應，從而達到抗氧化效果[14]。

2.3 大豆低聚肽的分離純化

大豆低聚肽是由多種肽段組成的低聚肽混合物，為了獲得單一肽段，需要對大豆低聚肽進行分離純化。常用的分離方法有高效液相色譜、離子交換層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠過濾色譜、超濾等。蛋白質及肽段分離中常常采用RP-HPLC法，具有操作簡單、色譜過程穩定、重復性好等優點，可作為一種高效的短肽分離手段[15]。大豆低聚肽的分離色譜圖見圖2，收集6個主要的組分峰，經冷凍干燥后，得到干粉狀樣品。6個組分的得率分別為1.84%、1.27%、1.35%、1.92%、2.25%、1.93%。

圖2 大豆低聚肽的RP-HPLC分離色譜圖Fig.2 RP-HPLC separation chromatogram of SOP

2.4 大豆低聚肽分離組分的體外抗氧化作用

濃度為2.0 mg/mL時，大豆低聚肽6個組分的DPPH自由基清除活性測定結果見圖3。

圖3 大豆低聚肽中RP-HPLC組分對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of RP-HPLC fraction of SOP on DPPH radical

通過對DPPH自由基清除活性分析可知，大豆低聚肽的6個組分均具有一定DPPH自由基清除活性，并且所有組分的抗氧化能力均比總肽強。這可能由于C18柱能夠將相同或相近疏水性的多肽富集在一起，這些肽段具有很多相同的氨基酸側鏈，而肽段的抗氧化活性與氨基酸側鏈上的某些基團有關，例如組氨酸的吲哚基團具有較強的抗氧化活性[16]，最終使得總體抗氧化能力增大。組分5#的活性最高((82.34±7.01)%)，清除率是大豆低聚肽((39.32±4.25)%)的2.1倍。進一步對組分5#的DPPH自由基清除能力進行IC50值分析，結果見圖4所示。經計算，組分5#的IC50值為1.0 mg/mL，呈顯著的量效關系。因此，選擇組分5#進行下一步的結構鑒定。

圖4 大豆低聚肽中組分5#對DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects of faction 5# of SOP on DPPH radical

2.5 大豆低聚肽中抗氧化肽的結構鑒定

蛋白質和多肽序列分析的傳統方法是用氨基酸分析儀或埃德曼降解法，但這些方法存在樣品需要量多、樣品純度要求高、耗時長等缺點。近年來，質譜在蛋白質和多肽領域的應用發展很快。其中，Q-TOF質譜儀是采用電噴霧離子源(ESI)和飛行時間質量分析器(TOF)，通過對各個組分二級質譜的碎片離子的質譜圖解譜得到肽段的氨基酸序列結構，樣品用量少，能夠對微量混合多肽進行序列分析及對新蛋白進行序列分析。利用Q-TOF質譜儀對組分5#進行分析，共鑒定出6個肽段，肽段結構如表1所示。

表1 Q-TOF MS鑒定出的大豆低聚肽組分5#的肽段結構

濃度為2.0 mg/mL時，6個肽段的DPPH自由基清除活性如圖5所示。

從圖5中可知，6個肽段均具有一定的DPPH自由基清除能力。其中，LY的清除能力最強((85.32±5.26)%)，LAGR((56.48±5.03)%)、FSR((49.87±3.62)%)次之，并且這3個肽段的清除能力均比同等濃度下的大豆低聚肽強((39.32±4.25)%)，因此，對大豆低聚肽的抗氧化活性起到了重要作用。進一步對LY、LAGR、FSR進行IC50值分析。經計算，LY、LAGR、FSR清除DPPH自由基的IC50值分別為0.9、1.8、2.0 mg/mL，呈顯著的量效關系。

圖5 大豆低聚肽中肽段對DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effects of peptides from SOP on DPPH radical

肽段的抗氧化活性與其氨基酸組成和一級結構有一定的關系[14](表1)。研究表明，抗氧化活性主要來源于具有抗氧化性的氨基酸，如Arg、Cys、His、Trp、Leu、Phe、Pro、Val、Tyr[17]。LY、LAGR、FSR中均含有抗氧化性氨基酸，這可能是3種肽段具有抗氧化活性的一個原因。Tyr是具有質子供體特性的氨基酸，能夠通過其供氫能力將氫原子給予自由基后，形成的苯氧自由基借助共振而穩定，從而導致自由基鏈式反應的減慢或終止[18]。LY中有Tyr，這可能是其DPPH自由清除活性較高的原因。此外，肽鏈內氨基酸之間的短程相互作用能夠強化作為質子供體的氨基酸的抗氧化活性，單純的氨基酸的抗氧化活性低于其所組成的抗氧化作用[14]。除LY、LAGR、FSR外，其余3個肽段也具有一定的DPPH自由基清除能力，盡管比大豆低聚肽弱，但是肽段間的協同作用也會對整體原料肽的活性起到一定的作用[19]。

3 結論

本文通過兩步酶解法制備出大豆低聚肽，以DPPH自由基清除能力為指標對其抗氧化活性進行了評價。其DPPH自由基清除能力呈顯著的量效關系，IC50值約為2.6 mg/mL。經RP-HPLC分離純化后，利用Q-TOF質譜儀對抗氧化活性最高的組分5#進行了結構鑒定，鑒定出的6個肽段均具有一定的DPPH自由基清除能力。其中LY、LAGR、FSR的DPPH自由基清除能力比大豆低聚肽高，是具有較高抗氧化活性的肽段，并且都是本研究新發現的大豆蛋白來源抗氧化肽。本研究明確了大豆低聚肽的抗氧化活性，并對其含有的抗氧化肽進行了分離和結構鑒定，為大豆低聚肽的開發和利用提供了理論基礎和實驗依據。

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Separation, purification and structural identification of antioxidant peptides derived from soybean oligopeptides

LIU Wen-ying, GU Rui-zeng, LU Jun, PAN Xing-chang, CAI Mu-yi*

(Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides,China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100015, China)

In order to investigate the activity and structure of antioxidant peptides derived from soybean oligopeptides (SOP), SOP was prepared by two-step enzymolysis. On the basis of analysis of compositions, the antioxidant activity of SOP was evaluated by DPPH radical scavenging activity. The results showed that the half-inhibition concentration (IC50) of DPPH radical scavenging activity of SOP was approximately 2.6 mg/mL. Then, SOP was separated and purified by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The DPPH radical scavenging activity was evaluated in 6 collected fractions. The results indicated that all fractions had higher DPPH radical scavenging activity than SOP. Finally, Q-TOF mass spectrometer was applied in identification of peptides in fraction # 5 and its DPPH radical scavenging activity of 6 identified peptides was analyzed. The results indicated that all the peptides exhibited DPPH radical scavenging activity and Leu-Tyr (LY), Leu-Ala-Gly-Arg (LAGR) and Phe-Ser-Arg (FSR) showed stronger activities than SOP. And they all had higher antioxidant capacity.

soybean oligopeptides; antioxidant peptides; separation and purification; structural identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702008

碩士，工程師(蔡木易教授級高級工程師為通訊作者，E-mail：caimuyi@vip.sina.com)。

國家十三五重點研發計劃(2016YFD0400604)；國家高技術研究發展計劃(863計劃)項目(2013AA102205-02)

2016-06-20，改回日期：2016-07-19