surfactin高產菌株的等離子體誘變及其高通量篩選

surfactin高產菌株的等離子體誘變及其高通量篩選

利用常壓室溫等離子體(atmospheric pressure and room temperature plasma, ARTP)方法對枯草芽孢桿菌BacillussubtilisE7進行快速誘變，篩選表面活性素(surfactin)高產菌株。采用表觀初篩，溶血圈初篩，孔板復篩，多功能酶標儀檢測，搖瓶驗證相結合的方法提高了篩選通量，加快了篩選進程，構建了高通量誘變篩選surfactin高產菌株的體系，并使用高效液相(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測方法對產物進行檢測。優化處理時間為220 s，獲得了遺傳穩定的突變菌株BacillussubtillusSF90-5，其產surfactin能力提高到約0.8 g/L，是原始菌株的5倍。ARTP誘變技術結合高通量篩選體系極大程度減少了工作量，提高了篩選通量，加快了篩選進度，并快速獲得了目的菌株，為脂肽類表面活性劑進一步的工藝研究提供了基礎。

surfactin；常壓室溫等離子體；枯草芽孢桿菌；高通量

脂肽類生物表面活性劑是一種由肽鏈和脂肪酸鏈組成的兩性分子，其一端為多個氨基酸組成的親水基肽鏈，另一端為親油基脂肪烴鏈。常見的脂肽類生物表面活性劑主要以同系物方式存在，主要成分有surfactin、fengycin、iturin等[1]。該類表面活性劑獨特的化學結構使其擁有廣譜抗菌性、更高的表面活性及耐熱、耐酸、穩定等特點，同時具有天然、低毒、可降解的優點，在食品、化妝品、專用化學品、農業、醫藥、石油開采及生物修復方面具有巨大的應用潛力[2]。隨著人們生活水平的提高，對食品添加劑及防腐劑的安全性要求越來越高，與傳統食品添加劑相比，脂肽類表面活性劑的廣譜抗菌性使其對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有較好的抑制性，且無毒、可降解、乳化性強、不會產生耐藥性，因此在新型食品保鮮中替代現有防腐劑、乳化劑等方面具有重要意義[3]。

目前所報道的產脂肽類生物表面活性劑的菌株主要有芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、沙雷氏菌屬(Serratiasp.)、曲霉菌屬 (Aspergillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、梭菌屬 (Clotridiumsp.)、隱桿菌屬(Empedobacterhaloabiumsp.)及游動放線菌屬(Actinoplanessp.)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)、節桿菌屬(Arthrobactersp.)、分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)等，研究較為深入的菌株主要集中在芽孢桿菌屬[4-6]。但天然芽孢桿菌產脂肽類生物表面活性劑的能力相對較低，開發成本較高，因此提高菌株的產脂肽能力，一直是研究人員追求的目標。閆冬等人采用原生質體融合的方法選育出抗菌脂肽高產菌株，最終以HPLC方法檢測得到surfactin產量為0.274g/L[7]。YAO等人在對發酵工藝進行調節后采用干重法最終獲得4g/L的脂肽類生物表面活性劑產量[8]。傳統的搖瓶篩選方式工作量大，步驟繁瑣，得到高產菌株的周期較長，因此，高通量的菌株篩選能有效加快高產菌株獲得速度,ZHU等人通過微孔板的方式最終獲得1株surfactin產量為0.473g/L的枯草芽孢桿菌[9]。

出發菌株B.subtilisE7，為河南大學發酵工程實驗室篩選獲得的1株surfactin高產菌株。為了進一步提高surfactin的產量，本研究采用常壓室溫等離子(atmospheric pressure and room temperature plasma， ARTP)的誘變方法，對B.subtilisE7進行誘變，以多孔板培養的方式擴大篩選量，構建了surfactin生產菌誘變及篩選的高通量模式，并獲得1株產量較高的surfactin生產菌，為進一步開發利用該菌株生產surfactin提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

枯草芽孢桿菌BacillussubtilisE7(河南大學發酵工程實驗室篩選保藏)。

1.1.2 培養基

種子培養液：葡萄糖20 g/L、酵母膏5 g/L、味精10 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO40.25 g/L。

血平板培養基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏0.1 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g/L，羊血50 mL/L。

搖瓶發酵基礎培養基：蔗糖30 g/L、尿素4 g/L、酵母膏1 g/L、KH2PO410 g/L、Na2HPO44g/L、NaCl 5 g/L、MgSO40.3 g/L，pH 8.2～8.3，滅菌條件為121 ℃，20 min。

1.2 儀器與設備

疊加式大容量恒溫培養搖床，常州英德生物科技有限公司；ARTP誘變儀，無錫源清天木生物科技有限公司；多功能酶標儀MD SpectraMax M2，Molecular Devices公司；高效液相色譜儀，島津Prominence LC-20A。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將4 ℃保藏菌種轉接活化平板，37 ℃培養12 h，挑取單菌落接入到種子活化瓶，37 ℃，200 r/min再次活化培養9 h。

1.3.2 發酵培養

將活化種子液以1%接種量接入搖瓶或24孔板中37 ℃，200 r/min發酵培養60 h。

1.3.3 ARTP誘變

在無菌環境內取10 μL種子液涂于無菌載片上，使菌液在載片表面均勻鋪開。置于ARTP中進行處理，處理距離2 mm、氣量10 SLM、功率120 W(以上參數均為機器恒定最佳參數，不需改變)[10]，處理時間梯度在60～300 s之間。將誘變處理后的載片置于1 mL無菌生理鹽水中，在漩渦振蕩器上振蕩約2 min將菌種洗下。將洗脫液稀釋至合適濃度后均勻涂布于種子平板進行復蘇，復蘇完成后根據菌株表觀特征選取菌株點接至血平板。挑取有明顯溶血圈的單菌落二次活化后保藏同時進行復篩。

1.3.4 高通量培養

傳統的搖瓶篩選方式工作量大，步驟繁瑣，單次處理量較低，不適合高通量篩選模式。深孔板由于其通量大、體積小而逐漸成為微生物培養及檢測等研究的主要選擇[9]，近些年來隨著微孔板搖床的研發水平進步，孔板培養的方式也逐步發展起來。根據孔的形狀微孔板主要分為圓形和方形兩種，根據孔數量適合微生物培養的主要有24、48、96孔等類型。由于發酵結束后需要足夠的發酵液進行檢測，考慮裝液量及實際培養效果后最終選定24孔方形孔板進行菌種活化及發酵培養[11]。

24孔板的最大裝液量為10 mL，發酵周期較長，裝液量過少在培養結束后剩余發酵液無法滿足檢測所需，裝液量過多則會影響發酵液中溶氧，且在搖床振動過程中發酵液會溢出，增加染菌風險，在經過多次預實驗對比效果后最終確定裝液量為2 mL[11]。

使用24孔深孔板對誘變所得菌種進行活化，種子液裝液量2 mL，挑取適量菌落后37 ℃，200 r/min條件下培養9 h，1%接種量轉接至裝有2 mL發酵液的24孔深孔板中，37 ℃，200 r/min條件下培養60 h。發酵結束后檢測其OD600及發酵液排油圈直徑，并計算其標準偏差(RSD)以驗證微孔板孔間平行性。

1.3.5 surfactin含量檢測

排油圈法[12]。發酵液離心取上清液。潔凈平板中倒入40 mL 40 ℃左右溫水，滴加15 μL原油液使其鋪勻，加入5 μL的發酵液上清，靜置30 s，量取排油圈的直徑Φ(cm)。

HPLC檢測：Inertsil ODS-SP C18反向色譜柱(5 μm×150 mm)。柱溫30 ℃，流動相分別為乙腈(含0.1%TFA)、去離子水(含0.1%TFA)。流速0.8 mL/min，檢測波長214 nm。0～3 min，乙腈濃度從45%梯度至50%；3～8min乙腈濃度由50%梯度至80%；8～25 min乙腈濃度由80%梯度至100%[13]。發酵液調pH 2使產物沉淀棄上清，甲醇復溶，0.4 μm濾膜過濾后進樣。

1.3.6 高通量檢測方法

氯化十六烷基吡啶-溴百里酚藍(CPC-BTB)比色法[14]： 0.2 mmol/L CPC(氯化十六烷基吡啶)和0.2 mmol/L BTB(溴百里酚藍)等體積混合在0.1 mol/L PBS(磷酸緩沖溶液，NaH2PO4/Na2HPO4，pH 8.0)中配制成CPC-BTB溶液。在酶標板內分別加入800 μL CPC-BTB溶液和100 μL發酵液上清樣品，25 ℃下反應5 min，使用酶標儀測定其A600nm。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變條件的確立

2.1.1 出發菌株生長曲線

B.subtillusE7從保藏斜面轉接至種子平板活化12 h后再次轉接至三角瓶內，37 ℃，200 r/min條件下培養獲得其生長曲線見圖1。

圖1 枯草芽孢桿菌出發菌株生長曲線Fig.1 Growth curve of B.subtilis E7

由圖1可看出，菌株在4 h進入對數期，12 h后結束對數生長期開始進入穩定期。一般對數中期的菌株在濃度以及生理特性方面都達到了較優水平，比較適合進行誘變處理[15]，因此本實驗選用9 h的菌株作為誘變樣品。

2.1.2 ARTP誘變處理時間

使用種子液，以不同的處理時間進行ARTP誘變，對菌株ARTP致死率進行測定。由圖2可以看出，誘變處理時間在60～150 s時，隨處理時間的增加，致死率增加；180 s時致死率達到99%；210 s時致死率達到99.4%；300 s致死率達到99.9%。為獲得surfactin高產及生存力較強的菌株，本研究選擇將致死率控制在99%以上。因此對產surfactin菌株合適的誘變處理時間為100～220 s。研究中發現220 s的處理劑量下菌株正突變率較高，在后續的研究中選取220 s作為實驗處理劑量。

圖2 脂肽合成菌ARTP誘變致死率曲線Fig.2 Plasma mutagenic lethality rate curve of B. subtis E7

2.1.3 高產surfactin突變株的初篩

經ARTP誘變后的菌株由于其基因發生突變，致使某些菌株在其表現型上也會發生部分變化，突變株形態大致可分為9種類型，分別對其從a-i進行編號。對不同形態菌株進行培養并對比其OD600和排油圈直徑后發現，菌落中間部位有凸起的為正突變菌株，其形態與原始菌株形態(a)相似(如圖3中b、c、e、f)，其OD600及發酵液排油能力都稍高；中間處凹陷，菌落偏小的為負突變株(如圖3中 d、g、h、i)發酵液排油能力較低或無排油能力[16]。

圖3 誘變后菌株外觀(左)與溶血圈初篩(右)Fig.3 Appearance of strain after mutagenesis (left) , diametr of hemolytic circle (right)

在對surfatin的研究中發現其具有較強的溶解血細胞的能力，因此在含血液的平板培養基培養過程中會出現溶血圈[17]。結合這一特性建立了通過溶血圈來篩選產surfactin菌株的經典血平板法。選取表觀初篩后所得的正突變表型菌株轉接至含有新鮮羊血細胞的的血平板培養基中，37 ℃培養12 h選取在血平板上有明顯溶血圈的菌株進行下一步篩選。

2.2 高通量篩選流程的建立

2.2.1 孔間平行性分析

由于深孔板孔數較多，因此實驗過程中在同一塊孔板中孔與孔之間發酵結果的平行是保證實驗結果可行且能與搖瓶發酵結果對比的關鍵[11]。

圖4 24孔板孔間平行性Fig.4 The parallelism between differentplates of 24 square deepwell plates

分別對24孔板中各孔發酵液OD600及發酵上清排油能力進行統計，統計結果如圖4所示。根據圖4所得結果比較其標準偏差RSD值后發現孔間OD600標準偏差(RSD)值為4.93%，發酵液排油圈直徑標準偏差(RSD)值為4.42%，兩標準偏差值均小于5%，證明孔間平行性達到要求，可用于發酵實驗的進行。

2.2.2 高通量檢測體系

溴百里酚藍(BTB)與氯化十六烷基吡啶(CPC)結合后顏色由深藍色變為淺黃綠色，surfactin作為一種帶負電荷的生物表面活性劑會與陽離子CPC結合從而使BTB游離出來，surfactin濃度不同，與CPC結合程度也會有差異，使作為顯色劑的BTB游離出的濃度也不同，從而顯色體系的顏色會由淺黃綠色漸變為鮮藍色[18-19]，顏色二次轉變的過程可以用分光光度計或者酶標儀測量。制作相應標準曲線，根據標準曲線得到surfactin濃度與A600nm之間關系的公式為:

y=0.034 25+0.352 88x

式中：y為surfactin濃度；x為A600nm。

由標準曲線可看出x與y值存在正相關性。但該標準曲線R2值偏小，僅為0.988 69，因此該標準曲線并不能作為準確定量發酵液中surfactin濃度的依據，該方法只能作為一個快速檢測模式在前期初篩的基礎上進一步篩選出產量相對較高的菌株。在之后仍需其他數據輔助驗證并進行搖瓶復篩。

圖5 600 nm處surfactin標準曲線Fig.5 The standard curve at 600 nm of surfactin

發酵樣本稀釋至合適濃度后加入含有CPC-BTB試劑的微孔板中，混合均勻后25 ℃下反應5 min，取120 μL轉移至酶標板并使用酶標儀測定其A600nm，將篩選出的顏色亮藍或在600 nm處吸光值較大的樣品使用250 mL三角瓶進行第二輪復篩，并用HPLC對復篩所得發酵樣本進行產量檢測后對比篩選出產量最高菌株。在經過多次ARTP誘變篩選后最終獲得1株surfactin高產菌株，經HPLC檢測其產量為0.8 g/L，并將其命名為B.subtilisSF90-5。

2.3 菌株驗證

2.3.1 與出發菌株的比較

使用三角瓶(250 mL裝液量40 mL)在37 ℃，200 r/min條件下發酵培養突變菌株B.subtilisSF90-5及原始菌株60 h，發酵結束后其生物量和產量對比結果如圖6。與原始菌株相比，B.subtilisSF90-5菌株發酵液生物量稍高于出發菌株，脂肽類表面活性劑合成明顯增加，且通過排油圈方法測得其排油能力相比出發菌株提高約2.3倍。

圖6 出發菌株B. subtis E7與B. subtis SF90-5菌株對比結果Fig.6 The different between B. subtis E7 and B. subtis SF90-5

分別將原始菌株與B.subtisSF90-5菌株發酵液調pH 2酸沉過夜，離心棄上清，沉淀用等量甲醇溶解，并用0.4 μm濾膜過濾。進樣50 μL并對比原始菌株及突變株B.subtisSF90-5在214 nm下的出峰圖，由圖7可以看出，原始菌株中surfactin產量為0.12 g/L，而突變株中surfactin含量則達到0.8 g/L，是原始菌株的7倍，在目前已發文獻中同樣處于較高水平，使用價值較強。

圖7 原始菌株與B. subtis SF90-5 HPLC檢測surfactin對比圖Fig.7 HPLC profile of surfactin produced by parent strain and B. Subtilis SF90-5

2.3.2B.subtilisSF90-5突變株的遺傳穩定性檢測

為了驗證所獲突變菌株的遺傳穩定性，將誘變所得B.subtilisSF90-5菌株用固體種子平板連續傳代5次，對5代菌株進行搖瓶發酵；同時對-85 ℃甘油管保存3個月的B.subtilisSF90-5菌株經活化后進行搖瓶發酵，結果見表1。由表1可知，在連續傳代培養后發酵液排油能力均在7.5左右,HPLC檢測所得產量均在0.8 g/L左右，表明誘變所得菌株B.SubtilisSF90-5具有良好的遺傳穩定性。

表1 B. subtilis SF90-5菌株的遺傳穩定性生物表面活性檢測

3 討論

本研究采用的誘變方式為常溫常壓等離子體(ARTP)誘變，ARTP是近些年來新興的一種誘變處理方式，其具有處理溫度低、常壓下就可產生高活性等離子體射流等優點。高活性的等離子體射流通過改變細胞膜通透性從而引起細胞基因損傷最終使其產生突變[20-21]。原始菌株在平板培養時菌落中間會有凸起，對突變株進行產surfactin驗證發現，突變株形態與原始株相似時surfactin產量較高，而當突變株菌落形態中間凸起消失，與原始菌形態差異較大時發酵不產或少產surfactin。WANG等人在阿維菌素鏈霉菌的ARTP誘變中發現了經ARTP誘變后的菌體形態與產量之間有著一定的相關性[22]，與本研究中枯草芽孢桿菌經ARTP誘變后，菌落形態與脂肽產量具有的相關性現象類似。因此，在誘變后首先以簡單表型初篩作為篩選依據可減少工作量，提高篩選效率[23]。

誘變育種與基因工程育種不同，ARTP引起細胞基因突變的效率雖高但卻有著很大的隨機性，因此大量的篩選工作是在誘變后獲得目的菌株的關鍵。高通量作為近年來比較熱門的一種研究思路，孔板在經過選型、裝液量及孔間平行性等預實驗之后可以完美代替搖瓶的工作，改善了搖瓶篩菌中工作量大，通量小等問題，短期內使篩選通量增加數十倍。多孔板的應用必然要結合高速快捷的檢測方法才能有效提高工作效率，真正實現高通量篩選。血平板法能有效在初篩過程中排除不產surfactin或產surfactin較少的菌株，CPC-BTB法可快速對枯草芽孢桿菌產surfactin的能力進行評定，2種方法的使用極大程度加快了篩選的進度。但CPC-BTB法并不能十分精確地對產物進行定量，該方法只能作為經過簡單初篩后快速篩選出產surfactin能力較強的菌株的依據，后續仍需通過傳統檢測方式對所篩選出的突變株進行搖瓶復篩并檢測產量。現階段深孔板搖床的使用已解決高通量發酵的問題，但為進一步加快篩菌速率，產物的快速檢測方法仍需進一步完善。

本研究旨在提供一種高效快捷的高通量誘變篩選流程。通過ARTP誘變結合高通量篩菌的方式成功獲得脂肽高產菌株B.SubtilisSF90-5。其發酵產量達到0.8 g/L，這為進一步的發酵工藝放大提供了有利的先導條件，為surfactin的進一步研究提供了重要基礎。而surfactin的產量與多種不同因素有關，除了菌種誘變外，發酵工藝的優化對其產量的提高也相當重要，同時易產泡的特性對surfactin發酵過程的穩定進行造成了一定困難，因此更高效的發酵模式的提出對surfactin的大規模生產也有著重要的影響。

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李光1，唐小玲1，韋璇3，朱學亮1，張勇2，張樂樂2，陳雙喜1*

1(河南大學 生命科學學院， 河南 開封，475000) 2(無錫源清天木生物科技有限公司，江蘇 無錫，214000)3(沈陽師范大學 生命科學學院，遼寧 沈陽，110000)

High-throughput screening ofBacillussubtilismutants with high yield of surfactinby ARTP

LI Guang1, TANG Xiao-ling1, WEI Xuan3, ZHU Xue-liang1,ZHANG Yong2, ZHANG Le-le2, CHEN Shuang-xi1*

1(School of Life Science, Henan University, Kaifeng 475000, China)2(Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co., Ltd, Wuxi 214000, China)3(College of Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

In this study,ARTP(atmospheric pressure and room temperature plasma, ARTP) method was used to obtain rapid mutagenesis ofBacillussubtilisE7 in atmospheric pressure and room temperature, to screen strain with high yield of surfactin. Several methods such as appearance screening, determination of diameter of hemolytic circle, culture in Microflask, detection by multifunctional enzyme standard detector, and shake flask test were combined to improve screening throughput and speed up screening process. A high-throughput screening system for mutant strain with high yield of surfactin was preliminarily built.High performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect target product. After mutagenesis for 220 s,Bacillussubtillusstrain SF90-5 with good genetic stability was obtained. Its surfactin yield increased to 0.8 g/L, which was 5 times of that of the original strain. Mutagenesis with ARTP resulted inreduced workload,effectively increased screening flux, and accelerated screening process. Desired target strain was obtained fleetly. This experiment provided a foundation for study of strain with high yield of surfactin.

surfactin; atmospheric pressure and room temperature plasma (ARTP);Bacillussubtilis; high-throughput

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702012

碩士研究生(陳雙喜教授為通訊作者，E-mail：csx1231@126.com)。

2016-08-16，改回日期：2016-10-21