傳統東北酸菜自然發酵過程中乳酸菌與營養物質同步分析

馬歡歡，呂欣然，林洋，孫夢桐，白鳳翎*，勵建榮

1(渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州,121013)2(北京林業大學 生物科學與技術學院，北京,100083)

傳統東北酸菜自然發酵過程中乳酸菌與營養物質同步分析

馬歡歡1，呂欣然2，林洋1，孫夢桐1，白鳳翎1*，勵建榮1

1(渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州,121013)2(北京林業大學 生物科學與技術學院，北京,100083)

通過對傳統東北酸菜發酵過程中乳酸菌數量與基質中還原糖和可溶性蛋白等營養物成分變化進行同步分析，結果表明，在5～15 ℃條件下發酵35 d進入成熟期，乳酸菌數為6.61 lg CFU/mL，比細菌數量高出1個數量級，成為優勢菌群；還原糖和可溶性蛋白含量降低至0.135%和0.073 6 mg/g，大部分營養成分被轉化為小分子風味物質，其主體風味物質為含硫化合物，與乳酸等酸性成分構成東北酸菜獨有的品質；亞硝酸鹽含量3.21 mg/kg，遠低于國家標準限量要求。乳酸菌菌群對傳統東北酸菜發酵過程中產品品質形成和安全性保障具有決定性作用。

東北酸菜；自然發酵；乳酸菌；營養物；同步分析

傳統東北酸菜以秋后大白菜為原料，經過晾曬、燙漂(或生漬)、裝缸、加水，自然低溫發酵一個多月后形成酸鮮純正、脆嫩芳香、清爽可口、增進食欲的地方特色傳統發酵食品[1-3]。乳酸菌在傳統發酵食品中的地位和作用越來越受關注，有關傳統東北發酵酸菜中乳酸菌分離、篩選與鑒定等已有相關報道[4]，而對發酵過程中乳酸菌對產品品質形成和亞硝酸鹽的降解同步研究相對很少。

傳統東北酸菜發酵過程中的乳酸菌來源于發酵原料和自然環境，可利用原料中的小分子糖類物質轉化為酸類代謝產物，賦予酸菜柔和的酸味；部分糖類物質被轉化為醇類代謝產物，酸性代謝產物與醇類代謝物質反應后形成酯類物質，賦予產品以醇香和酯香的風味特征[5]。乳酸菌通過蛋白水解系統分解發酵基質中的可溶性蛋白形成短肽和氨基酸等小分子代謝產物，賦予產品獨特的鮮味特征[6]。此外，發酵初期一些雜菌可將原料中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽并在基質中蓄積，食入過量會對人體健康造成嚴重危害。乳酸菌具有合成亞硝酸鹽還原酶的能力，能高效、特異性降解酸菜中的亞硝酸鹽[7-8]。朱軍莉等[9]從自然發酵蔬菜制品中分離出3株具有較好降解亞硝酸鹽的菌株LactobacillusplantarumH12、Lb.plantarumL7和、Lb.plantarumX1，亞硝酸鹽降解率均高于89%。盧海強等[7]從傳統東北酸菜中分離獲得產亞硝酸還原酶菌株LeuconostocgelidumR11，在含125 mg/L NaNO2的MRS培養基中誘導48 h，亞硝酸鹽還原酶活力為68.4 U/mL。

本研究通過對傳統東北酸菜發酵過程中乳酸菌演變與營養物質和亞硝酸鹽變化進行同步分析，探究乳酸菌菌群對酸菜發酵中風味物質形成和亞硝酸鹽降解的地位和作用，為挖掘傳統發酵食品工藝中乳酸菌的作用機制奠定理論基礎，對傳統發酵食品工藝現代化應用提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大白菜：錦州市白樓農貿市場，選取成熟、無蟲害、無腐爛且新鮮的大白菜。

1.2 培養基與試劑

PCA、MRS培養基，北京奧博星生物技術有限公司；考馬斯亮藍G-250，天津市福晨化學試劑廠；牛血清蛋白，北京索萊寶生物科技有限公司；醋酸鉛、硫酸鈉、磷酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉等(均為分析純)，天津市風船化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

SPX-250生化培養箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺，東聯哈爾(北京)儀器制造有限公司；GI54DS高壓滅菌鍋，至微儀器有限公司；THZ-D臺式恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠；PHSJ-3F型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；5424R冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司； UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津公司；7890A氣質聯用儀：安捷倫科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 工藝操作要點

(1)原料處理：將葉綠心黃成熟的中國大白菜在通風陽光充足下晾曬殺菌7 d，使其水分部分蒸發，將晾曬好的大白菜去根和外層菜葉，洗凈晾干。

(2)熱燙：將處理好的白菜浸入沸水中熱燙1～2 min，放在通風處晾干。

(3)腌漬：按每100 kg大白菜在缸底添加200 g食鹽，然后將白菜層層碼入陶缸至缸口，在上面壓上條石，用60～70 ℃溫水充滿缸，用塑料布封口。

(4)發酵：在5～15 ℃條件下自然發酵。

1.4.2 取樣

發酵起始時間2015年11月21取樣為0 d后每隔5 d取次樣，分別為發酵第0、5、10、15、20、25、30、35、40 d，從液面下10 cm處5點取樣，共取汁液100 mL于滅菌三角瓶中，4 ℃下備用。

1.4.3 乳酸菌數測定

乳酸菌計數采用平板稀釋法[10]，準確量取上述酸菜發酵液10.0 mL加入到90 mL無菌生理鹽水中，振蕩5 min，室溫下靜止10 min。吸取1.0 mL加入到9.0 mL無菌生理鹽水中，依次稀釋相適應的濃度，吸取1.0 mL不同梯度的稀釋液，分別加入到滅菌平板中，后傾注冷卻至40～45 ℃ MRS瓊脂培養基25.0 mL左右，37 ℃培養48 h。

1.4.4 發酵液中營養物分析

1.4.4.1 pH測定

用pH計測定1.4.2酸菜發酵液樣品的pH。

1.4.4.2 還原糖含量測定

參照文獻[13]中的方法并稍作修改進行還原糖的測定。取10.0 mL發酵汁液于50 mL離心管中，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，分別取6.0 mL上清液和4.0 mL菲林試劑于試管中，搖勻加塞后在沸水浴中加熱15 min，取出后立即用自來水冷卻至室溫后，4 ℃下4 000 r/min離心10 min。取上清液在590 nm處測定吸光值。

1.4.4.3 可溶性蛋白含量測定

參照文獻[13]中的考馬斯亮藍染色法測定可溶性蛋白。吸取2.0 mL發酵汁液于離心管中，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，取1.0 mL上清液以蒸餾水為空白對照組，放入帶塞試管中，加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250溶液，充分混合，放置2 min后，在595 nm處測定吸光值。

1.4.5 HP-SPME-GC-MS分析酸菜中揮發性成分

頂空固相微萃取(HP-SPME)取樣：將SPME的萃取纖維頭放在氣相色譜的進樣口老化，老化溫度300 ℃，老化時間1 h。取2 mL發酵40 d基液于15 mL頂空進樣瓶中，插入75 μm PDMS萃取纖維頭，加入微型磁力攪拌子，于室溫50 ℃下恒溫平衡40 min。拔出萃取頭后迅速插入氣相色譜儀進樣口，250 ℃解析10 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，啟動儀器采集數據。

氣相色譜(GC)條件：HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性毛細管柱；進樣口溫度270 ℃；載氣為He；不分流模式進樣；起始溫度40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升溫至250 ℃，保持8 min，在以20 ℃/min升至270 ℃保持1 min。

質譜(MS)條件：色譜-質譜接口溫度280 ℃，離子源溫度 230 ℃；四級桿溫度為 150 ℃；離子化方式：EI；電子能70 eV；質量掃描范圍m/z30～50。

定性和定量分析：樣品中揮發性成分定性分析首先經氣相色譜分離，用質譜進行鑒定。分析結果利用計算機譜庫(Nist/Wiley)進行初步檢索及資料分析，結合相關文獻，確定揮發性物質的化學組成。通過各揮發性化合物的峰面積進行定量分析。

1.4.6 安全指標測定

1.4.6.1 細菌菌落總數測定

按國家標準GB 4789.2—2010的方法進行測定[11]。

1.4.6.2 亞硝酸鹽測定

按GB 2005.33—2010中分光光度法進行測定[12]。

1.4.7 數據處理

所有實驗均重復測定3次，數據采用(平均值±標準差)表示。采用SPSS 18.0軟件對實驗數據進行統計和顯著性分析，采用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌與pH、還原糖和可溶性蛋白的同步分析

2.1.1 pH值

pH是影響傳統東北酸菜產品品質的重要因素之一。圖1是傳統東北酸菜發酵過程中乳酸菌和基質pH的變化情況，從中可看出，發酵0～10 d之間，發酵液的pH快速下降(P<0.05)，從pH 6.69下降到pH 4.33，乳酸菌在這一階段處于持續上升趨勢，可能是乳酸菌在厭氧條件下分解糖類產生乳酸等酸性物質[16]。發酵從10～25 d期間，pH維持在pH 4.33～4.18之間，pH變化不顯著；發酵從30～40 d，pH進一步下降并穩定在pH 3.74～3.64之間。pH降低不僅能夠影響一些不耐酸的微生物生長繁殖，同時也賦予了酸菜柔和的酸味[5]。杜書等[6]研究發現，pH值在整個發酵過程中持續下降，最終發酵成熟時pH維持在3左右，與本研究結果相似。

圖1 傳統東北酸菜發酵過程中基質pH變化Fig.1 Changes of pH during fermentation of traditional Northeastern Suancai in China

2.1.2 還原糖含量

乳酸菌可利用還原糖生成醇、酸和酯等風味物質。如圖2所示，還原糖含量在整個發酵過程中呈下降的趨勢。發酵從0～15 d，還原糖含量較高，為乳酸菌提供了豐富的營養物，使其大量繁殖；隨著乳酸菌數量增加，在發酵15～20 d，還原糖含量由1.93%下降到0.10%，呈顯著水平(P<0.05)；發酵20～35 d期間，還原糖含量維持在0.10%左右，35 d時還原糖含量出現上升，原因是發酵原料中的糖類溢出。第40天時，還原糖含量進一步下降至0.007%，原因是乳酸菌上升后進一步分解糖類產生醇、酸和CO2等風味物質[17]。結果表明，乳酸菌降解還原糖主要發生在0 d到20 d左右。

圖2 傳統東北酸菜發酵過程中還原糖含量的動態變化Fig.2 Changes in water sugar content during fermentation of traditional northeastern Suancai in China

2.1.3 可溶性蛋白含量

乳酸菌可利用原料中的可溶性蛋白，產生氨基酸和多肽等小分子物質。圖3是傳統東北酸菜發酵過程中乳酸菌和可溶性蛋白動態變化曲線，從中可看出，可溶性蛋白含量呈先下降后上升再下降的趨勢。發酵從0～10 d時，可溶性蛋白含量下降速度最快，達到顯著性水平(P<0.05)，可溶性蛋白含量由0.132 8 mg/g下降到0.070 7 mg/g，乳酸菌在這期間處于持續上升趨勢[16]。發酵10～35 d期間，可溶性蛋白含量呈上升的趨勢，由0.070 7 mg/g上升至0.073 6 mg/g(P>0.05)。發酵40 d時，發酵液中可溶性蛋白含量降低至0.053 3 mg/g。DO等[18]研究表明，Lactobacillusdelbrueckii具有能夠編碼氨肽酶、氨基酸支鏈酶和蛋白質水解酶等基因，從而合成相應的酶降解蛋白質和支鏈氨基酸產生游離氨基酸等。結果表明，乳酸菌對可溶性蛋白的利用主要發生在0～10 d左右。

圖3 傳統東北酸菜發酵過程中可溶性蛋白含量的動態變化Fig.3 Changes in water soluble protein content during fermentation of traditional northeastern Suancai in China

2.2 揮發性風味成分分析

采用GC-MS聯用，共檢測到發酵液中30種揮發性化合物，表1列出了揮發性物質數量及含量占總揮發性物質的比例。從中可看出，共鑒定出醇類5種，胺類、酸類、酯類、烷類和烯類各2種，含硫化合物6種，酚類3種，腈類1種；除此之外，還含有少喹啉、吲哚和含苯環的其他物質。二甲基三硫和1-異硫代氰酸丁酯相對含量較高為29.16%和11.53%，其次是5-己腈、棕櫚酸、二甲基二硫和3-丁烯基異硫氰酸酯。其中，二甲基二硫具有刺激性的洋蔥味，二甲基三硫具有肉樣和洋蔥蔬菜樣香氣，均來源于大白菜中的蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸等含硫氨基酸的降解產物，如甲硫醇氧化后形成含硫化合物，氣味閾值較低，對酸菜的風味貢獻較大[19]。1-異硫代氰酸丁酯和3-丁烯基異硫氰酸酯具有強烈辛辣味和芳香味，大白菜組織細胞破裂后細胞中芥子苷在芥子酶催化作用下水解，在pH 5.0～8.0時產生異硫氰酸酯類，在pH 2.0～4.0時形成5-己腈和苯代丙腈等腈類化合物[20]。酸菜中酸類物質來源于發酵過程中乳酸菌代謝中的氨基酸脫氨反應，如棕櫚酸和肉豆蔻酸等。結果表明，酸菜發酵成熟后風味物質以含硫化合物、烯類、酸類和醇類為主，相對含量分別為60.08%、11.43%、10.70%和4.98%。其中二甲基三硫和異硫氰酸酯類對產品的風味貢獻較大。杜書等[21]研究發現自然發酵酸菜中的主體風味成分為二甲基二硫、二甲基三硫和(E,Z)-2,6-壬二烯醛，與本研究主體風味成分相似。

表1 傳統東北酸菜主要揮發性風味物質及其相對含量

2.3 乳酸菌與細菌菌落總數和亞硝酸鹽變化

在傳統東北酸菜發酵初期，乳酸菌和雜菌共存于發酵基質中，隨著發酵進行發酵基質形成了微好氧環境，促進乳酸菌的生長繁殖，而使一些需氧性雜菌生長受到抑制[14]。圖4是傳統東北酸菜腌漬過程中乳酸菌、細菌菌落總數和亞硝酸鹽含量的同步變化。從中可看出，乳酸菌數量呈現先揚后抑再上升并趨于平穩的發展過程，細菌菌落總數則是先上升然后逐步下降的走向。發酵初期原料中乳酸菌為2.15 lg CFU /mL低于細菌菌落總數1個數量級。發酵從0 d到10 d期間，乳酸菌和細菌菌落總數呈同步上升，第10 d達到峰值，此時細菌菌落總數高出乳酸菌3個數量級。第20 d細菌菌落總數仍高于乳酸菌占主導地位。發酵后期35 d到40 d乳酸菌上升至6.64 lg CFU/mL，細菌菌落總數下已降至5.54 lg CFU/mL，乳酸菌明顯高于細菌菌落總數成為優勢菌群。

發酵原料中含有假單胞菌屬、腸桿菌科和葡萄球菌屬等雜菌形成硝酸鹽還原酶可將植物體內的硝酸鹽轉變為亞硝酸鹽[22]。而乳酸菌產生的亞硝酸鹽還原酶可降解發酵酸菜中的亞硝酸鹽，其機理分為2個階段，發酵初期，發酵液pH高于4.5以酶降解為主；發酵后期，pH低于4.0以酸降解為主[8]。如圖4所示，亞硝酸鹽含量呈先上升后下降最后達到穩定的趨勢。發酵從0～15 d期間，亞硝酸鹽含量呈上升的趨勢，發酵第15天時達到最大值為24.17 mg/kg超過國家限定標準。發酵20～30 d亞硝酸鹽含量快速下降，達到顯著水平(P<0.05)，發酵30 d亞硝酸鹽含量下降到4.13 mg/kg。發酵30～40 d，亞硝酸鹽的含量繼續下降，最終維持在3.0 mg/kg左右，遠低于20 mg/kg的國家限量標準[15]。

3 結論

傳統東北酸菜自然發酵過程中乳酸菌為優勢微生物類群，能有效提高產品的風味品質并延長貯藏期。本研究通過傳統東北酸菜自然發酵過程中乳酸菌與營養物質的同步分析，表明乳酸菌可利用發酵基質中還原糖、可溶性蛋白等形成各類風味成分，其主體風味物質為含硫化合物。乳酸菌可降低基質中pH，有效抑制其他微生物生長，并對酸菜中亞硝酸鹽具有降解作用。發酵30 d后酸菜進入可食用期，35 d后為最佳食用期。本研究結果表明乳酸菌在傳統東北酸菜自然發酵過程中對產品風味及特有品質形成起到決定性作用，并能夠降解亞硝酸鹽和抑制雜菌生長，使產品安全性得到保障。本研究為傳統東北酸菜現代化生產提供理論和應用參考。

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Synchronization analysis of lactic acid bacteria and nutrients during fermentation of traditional Northeastern Suancai in China

MA Huan-huan1, LV Xin-ran2, LIN-yang1, SUN Meng-tong1,BAI Feng-ling1*, LI Jian-rong1

1(College of Food Science and Technology, Bohai University; Food Safety Key Lab of Liaoning Province;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Jinzhou 121013, China)2(College of Biology Science and Technology, Beijing Forest University, Beijing 100083, China)

Lactic acid bacteria (LAB)are the major microbe flora in natural fermentation fluid of traditional Northeastern Suancai in China, which plays a key role in the formation of flavor and the degradation of nutrient substances. In this study,the changes in the counts of LAB, reducing sugars and soluble protein during the fermentation process of traditional Northeastern Suancai were synchronously analyzed. The results indicated that Suancai fermented by LAB entered into the mature period in 35 days at 5-15 ℃. The LAB became dominant microbes with counts of 6.61 lg CFU/mL, which was 1.0 log units higher than total number of bacterial colonies. The contentsof reducing sugar and soluble protein decreased to 0.135% and 0.073 6 mg/g, respectively, which indicated that most nutrient substances were transformed into small molecular flavor substances. The main flavor substances were sulfur compounds, which was combined with lactic acid and other acidic ingredients to constitute the unique quality of Suancai. Moreover, the content of nitrite in Suancai was 3.21 mg/kg, which was lower than the requirement of national standard. LAB had a decisive influence on the formation of product quality and the security measure during the fermentation process of traditional Northeastern Suancai.

Northeastern Suancai；natural fermentation；lactic acid bacteria；nutrients； synchronization analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702014

碩士研究生(白鳳翎教授為通訊作者，E-mail：baifling@163.com)。

遼寧省科技廳攻關項目(2015103020)；泰山學者藍色產業領軍人才團隊支撐計劃項目 ( 魯政辦字(2015)19號

2016-09-23，改回日期：2016-10-19