以豆粕粉為氮源的枯草芽孢桿菌液態發酵生產納豆激酶

董艷山,高麗,何加亨,胡彪群,范青云,王業富*

1(武漢大學 生命科學學院，病毒學國家重點實驗室，湖北 武漢，430072) 2(武漢真福醫藥股份有限公司，湖北 武漢，430075)

以豆粕粉為氮源的枯草芽孢桿菌液態發酵生產納豆激酶

董艷山1,高麗2,何加亨2,胡彪群2,范青云2,王業富1*

1(武漢大學 生命科學學院，病毒學國家重點實驗室，湖北 武漢，430072) 2(武漢真福醫藥股份有限公司，湖北 武漢，430075)

枯草芽孢桿菌液態發酵通常采用蛋白胨作為氮源生產納豆激酶，導致生產成本過高，發酵液中酶活性較低。采用價格低廉的豆粕粉作為氮源不僅大幅度降低了原料成本，而且顯著提高了發酵液中的酶活性。在搖瓶實驗中優化確定豆粕粉最佳添加量，并在此基礎上優化確定了最佳接種量、發酵液初始pH、發酵時間。最終搖瓶發酵液中酶活達到5 471 IU/mL，是等量胰蛋白胨作為氮源發酵的3.6倍。上述搖瓶發酵參數進一步在7 L發酵罐和200 L中試水平發酵罐進行驗證，并優化確定發酵過程中控制溶氧水平為30%，納豆激酶活性分別達到6 717 IU/mL和4 236 IU/mL。

豆粕粉；枯草芽孢桿菌；納豆激酶；發酵

根據《中國居民營養與慢性病狀況報告(2015)》報告數據顯示，我國心腦血管疾病的死亡率為271.8/10萬，已成為國民最主要死因[1]。誘發心腦血管疾病的根本原因是血栓的形成，而目前市場上溶栓藥物基本都是急救藥物，存在藥效時間短，出血性副作用等缺陷[2-3]。納豆激酶是由日本科學家1987年首次在古老的發酵食物納豆中發現，該酶表現出非常強的纖維蛋白/原水解活性[4]。在動物實驗中，納豆激酶無論是注射還是口服給藥都具有溶解纖維蛋白/原，再通血管的功效[5-15]。并且，該酶制劑在人體試驗中，通過口服用藥也得到了非常好的功效驗證[16-19]，具有非常好的安全性，基本不會引起毒副作用[20-23]。

因此，納豆激酶被認為是最具發展前景和市場應用價值的新一代預防和治療心腦血管疾病的理想天然溶栓藥物。但是，固體發酵產物納豆中納豆激酶含量非常低，且固體發酵工藝成本高且費時耗力。近年來依靠枯草芽孢桿菌液體發酵生產納豆激酶已經成為趨勢[24-28]。然而，枯草芽孢桿菌液體發酵存在的主要問題是發酵培養基中使用蛋白胨作為氮源，造成成本過高，同時納豆激酶含量還有待進一步提高。

綜上，本研究采用廉價的豆粕粉作為氮源，優化了豆粕粉使用濃度。并在此基礎上進行了搖瓶發酵參數的優化，小試與中試規模的發酵罐發酵工藝優化與驗證。最終發酵液中納豆激酶活性得到了大幅度的提升，是現有發酵工藝的3倍以上。從而為枯草芽孢桿菌發酵生產納豆激酶進行食品和藥物開發大幅度縮減了生產成本，并提供了可靠的發酵工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

大豆豆粕粉，為黃豆榨油之后的廢料豆粕經過粉碎制備得到，來源于山東萬得福實業集團有限公司。

1.1.2 菌種

本課題組自主篩選的1株產納豆激酶枯草芽孢桿菌，由本實驗室自行保存。

1.1.3 主要試劑

胰蛋白胨、酵母提取物，英國Oxoid公司；葡萄糖、NaH2PO4、Na2HPO4，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗設備

7 L發酵罐，上海保興生物設備有限公司；200 L發酵罐，江蘇科海生物設備有限公司；溶氧，pH電極，梅特勒-托利多儀器有限公司；5424 R離心機，Eppendorf 公司；電子天平 JY，上海浦春計量儀器有限公司；DH5000電熱恒溫培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SA-300VA高壓滅菌鍋；SHZ-82氣浴恒溫培養箱，金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 分析方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌種子液制備

保藏菌種在YPD固體培養基表面劃線，挑取單菌落接種于YPD液體培養基(250 mL三角瓶含有50 mL培養基)進行培養。

1.3.2 枯草芽孢桿菌搖瓶發酵

所用三角瓶為250 mL量程，發酵裝液量為50 mL。

(1)豆粕粉濃度優化實驗：所用發酵培養基含有葡萄糖10 g/L、 Na2HPO4·12H2O 3 g/L、NaH2PO4·2H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 1 .5 g/L、CaCl20.2 g/L，初始pH為7.0。此外，設置豆粕粉質量體積百分比(m/v)分別為2%、3%、4%、5%。接種量為5%。

(2)接種量優化實驗：所用發酵培養基含有葡萄糖10 g/L、 Na2HPO4·12H2O 3 g/L、NaH2PO4·2H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 1 .5 g/L、CaCl20.2 g/L，初始pH為7.0。豆粕粉含量為豆粕粉濃度實驗優化的結果。接種量為5%。

(3)初始pH優化實驗：所用發酵培養基含有葡萄糖10 g/L、 Na2HPO4·12H2O 3 g/L、NaH2PO4·2H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 1 .5 g/L、CaCl20.2 g/L，通過NaOH溶液和鹽酸調節發酵液初始pH分別為5、6、7、8、9。豆粕粉含量為豆粕粉濃度實驗優化的結果。接種量為接種量實驗優化結果。

(4)豆粕粉與胰蛋白胨發酵實驗對比：所用發酵培養基含有葡萄糖10 g/L、 Na2HPO4·12H2O 3 g/L、NaH2PO4·2H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 1 .5 g/L、CaCl20.2 g/L。接種量為接種量優化實驗結果。初始pH為pH實驗優化結果。豆粕粉含量為豆粕粉含量實驗優化的結果，等量胰蛋白胨代替豆粕粉研究兩種氮源對發酵的影響。

1.3.3 枯草芽孢桿菌小試與中試發酵罐發酵

發酵培養基與搖瓶相同，接種量、豆粕粉含量、初始pH為搖瓶實驗優化參數。通過溶氧與攪拌相關聯控制溶氧水平。

1.3.4 納豆激酶活性測定方法

2.成人及青少年初始抗反轉錄病毒治療方案：初治患者推薦方案為2種NRTIs類骨干藥物聯合第三類藥物治療 。第三類藥物可以為NNRTIs或者增強型PIs（含利托那韋或考比司他）或者INSTIs；有條件的患者可以選用復方單片制劑 （STR）。 基于我國可獲得的抗病毒藥物，對于未接受過HAART的患者推薦及替代方案見表4。

稱量0.15 g的瓊脂、0.175 5 g NaCl，加到50 mL小錐形瓶中；量取20 mL的20 mmol/L的pH為8.0的Tris-Hcl緩沖液，溶解瓊脂；錐形瓶加塞置于微波爐中加熱溶解；待錐形瓶冷卻至50 ℃時向瓶中加入1 mL 50 mg/mL的纖維蛋白原溶液及100 μL 100 U/mL的凝血酶，混合均勻后迅速傾入滅菌平皿中；室溫放置30 min，以形成纖維蛋白凝塊。用打孔器在纖維蛋白平板上打7個孔，并做好標識；取10 μL濃度為320、160、80、40、20 IU/mL的標準尿激酶溶液到對應的孔中，放置10 min后轉至37 ℃恒溫培養箱中反應，18 h后取出測定各溶解圈的垂直兩直徑；上述操作設定3個平行組，測量后取其平均值；再用垂直直徑的乘積的常用對數為橫坐標，標準尿激酶濃度的常用對數為縱坐標，制作尿激酶酶活標準曲線。取待測樣品10 μL按上述操作上樣于同一平皿，37 ℃恒溫培養箱中反應，18 h后測量溶解圈的垂直兩直徑，根據標準曲線方法及稀釋濃度求出樣品的酶活力大小。

2 實驗結果與分析

2.1 以豆粕粉為氮源的枯草芽孢桿菌搖瓶發酵參數優化

2.1.1 基于枯草芽孢桿菌生長曲線的最佳種子液生長狀態的確定

將低溫保藏的枯草芽孢桿菌菌株平板劃線培養，挑取1個單菌落接入搖瓶中進行菌種活化培養。如圖1所示，培養前12 h為延滯期，在第14 h進入對數生長期，第20 h達到菌液濃度的頂峰，第22 h開始進入衰亡期。從種子液的生長曲線可以看出，在14～20 h之間為對數生長期，并且第18 h處于對數生長期的中期，此時菌種生長最活躍旺盛，OD600為0.63，因此，在后期發酵培養種子液活化過程中應當選擇活化18 h左右，菌液濃度OD600為0.6左右的菌液作為種子液用于發酵培養。

圖1 枯草芽孢桿菌在搖瓶中生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis in shake flask

2.1.2 枯草芽孢桿菌發酵最佳豆粕粉添加量的確定

根據枯草芽孢桿菌生長曲線研究結果，取單菌落活化18 h的種子液用于后續的發酵試驗研究。設置豆粕粉質量體積百分比分別為2%、3%、4%、5%的4個濃度用于枯草芽孢桿菌發酵，結果如圖2所示。在4個豆粕粉濃度條件下，在前36 h內，發酵液中納豆激酶活性處于直線上升狀態，除在2%豆粕粉條件下發酵液中納豆激酶活性在第36 h達到活性最高值的3 725 IU/mL之外，在3%、4%、5%豆粕粉濃度條件下，發酵液中納豆激酶活性在第42 h達到峰值，活性大小分別為5 480、5 019、4 015 IU/mL，其中3%豆粕粉發酵條件下，發酵液活性最高。

圖2 豆粕粉對發酵液納豆激酶酶活的影響Fig.2 The effects of soybean cake powder on nattokinase activities in media

2.1.3 枯草芽孢桿菌發酵豆粕粉最佳接種量和最適pH的確定

設置接種量分別為1%、2.5%、5%、7.5%、10%，發酵時間為42 h，對酶活影響結果如圖3所示。在接種量為5%的發酵條件下，酶活為5 513 IU/mL，分別是在接種量為1%、2.5%、7.5%、10%發酵條件下的1.44、1.21、1.14、1.31倍，因此 5%為最佳接種量。

圖3 接種量對發酵液納豆激酶酶活的影響Fig.3 The effects of inoculum size on nattokinase activities in media

圖4 發酵液初始pH對發酵液納豆激酶酶活的影響Fig.4 The effects of initial pH on nattokinase activities in media

2.2 豆粕粉枯草芽孢桿菌發酵顯著優于胰蛋白胨發酵

在傳統的枯草芽孢桿菌液體發酵過程中，一般使用蛋白胨作為重要的氮源物質，但是蛋白胨的高成本是必須面臨的問題。本試驗將豆粕粉發酵與傳統的蛋白胨發酵進行比較，結果如圖5所示。在同樣都是3%濃度條件下，在第42 h發酵時間，胰蛋白胨發酵液中酶活為1 522 IU/mL，而豆粕粉發酵液中酶活高達5 471 IU/mL，是胰蛋白胨作為氮源發酵的3.6倍。此結果表明以價格低廉的豆粕粉作為枯草芽孢桿菌發酵氮源進行納豆激酶生產綜合效果要遠高于胰蛋白胨作為原料發酵。

圖5 豆粕粉與胰蛋白胨對發酵液納豆激酶酶活的影響Fig.5 The effects of soybean cake powder and tryptone on nattokinase activities in media

2.3 枯草芽孢桿菌小試發酵工藝優化和驗證

7 L發酵罐工作體積為4 L，根據搖瓶發酵參數的優化結果，設置培養基中豆粕粉含量為3%，初始pH 7.0，接種量為5%。設置溶氧與攪拌聯動，溶氧設定為50%。發酵液酶活曲線如圖6所示。同樣在第42 h發酵液中酶活達到最高峰值為6 519 IU/mL。

圖6 枯草芽孢桿菌在20 L發酵罐中的生長曲線Fig.6 Growth curve of Bacillus subtilis in 20 L fermentation tank

對于枯草芽孢桿菌發酵罐的發酵培養，溶氧是非常關鍵的工藝參數，本試驗進一步通過溶氧與攪拌轉速相關聯，研究了不同溶氧水平對發酵酶活的影響。根據上述實驗結果，發酵第42 h在10%、30%、50%、70%溶氧水平下，發酵液中酶活分別為4 075、6 717、6 033、4 822 IU/mL。因此，枯草芽孢桿菌發酵罐發酵的最佳溶氧水平應控制在30%左右。

圖7 溶氧水平對發酵液納豆激酶酶活的影響Fig.7 The effects of dissolved oxygen level on nattokinase activities in media

2.4 枯草芽孢桿菌中試發酵工藝驗證

為了進一步驗證前期搖瓶發酵參數與小試發酵罐發酵工藝，本試驗采用中試規模的200 L發酵罐對上述參數和工藝進行驗證。200 L發酵罐工作體積為120 L，根據搖瓶發酵參數和工藝的優化結果，設置培養基中豆粕粉含量為3%，初始pH 7.0，接種量為5%，溶氧為30%。與搖瓶與小試發酵罐相比，中試發酵規模過程中，發酵液酶活達到最高值時間為第48 h，大小為4 236 IU/mL。這一結果雖然與小試發酵水平相比，活性有所降低，但是仍然是有文獻報道實驗結果中最高的納豆激酶生物學活性。

圖8 枯草芽孢桿菌在200 L發酵罐中的生長曲線Fig.8 Growth curve of Bacillus subtilis in 200 L fermentation tank

3 討論

蛋白胨是目前枯草芽孢桿菌發酵生產納豆激酶的常用氮源[29]，蛋白胨價格高昂，勢必造成生產成本過高。即使采用蛋白胨作為氮源用于液體發酵，發酵液中納豆激酶活性也非常有限[24-26,29-30]。張琳等采用胰蛋白胨作為氮源，搖瓶水平納豆激酶活性為1 004 IU/mL[24]；任武賢等采用胰蛋白胨作為氮源，搖瓶水平納豆激酶活性為2 051 IU/mL[25]；熊曉輝等采用胰蛋白胨作為氮源，5 L發酵罐水平納豆激酶活性為2 250 IU/mL[26]；張鋒等采用大豆蛋白胨，搖瓶水平納豆激酶活性為1 000 IU/mL[30]。因此，目前以價格高昂的蛋白胨作為氮源的枯草芽孢桿菌液體發酵的納豆激酶活性普遍在1 000～2 000 IU/mL左右，仍待進一步提高。

本研究采用價格低廉的豆粕粉作為枯草芽孢桿菌液體發酵的氮源生產納豆激酶，優化確定了豆粕粉的添加量，并且優化了系列發酵參數，在搖瓶發酵水平，納豆激酶活性可達到5 471 IU/mL，與等量胰蛋白胨作為氮源發酵相比，酶活有了3.6倍的顯著提升。與蛋白胨相比，為什么豆粕粉作為氮源更有利于枯草芽孢桿菌表達分泌納豆激酶，其機理還不清楚?？赡苁怯捎诙蛊煞叟c蛋白胨相比含有高含量的大豆纖維蛋白，因為納豆激酶可特異性水解纖維蛋白，只有纖維蛋白被水解成小分子短肽才能進一步被枯草桿菌吸收利用，用于自身的生長代謝?？赡苁谴蠖估w維蛋白對納豆激酶的產生具有誘導作用，這一作用需要在后續的試驗中進行研究驗證。

任武賢等采用1%蛋白胨作為氮源，最佳接種量為3%，最適pH 7.0～7.2[25]；熊曉輝等2%胰蛋白胨作為氮源，最佳接種量為5%，最適pH 7.0[26]。張立等采用2%胰蛋白胨作為氮源，最佳接種量為5%，最適pH 7.22[31]。本研究中，以3%豆粕粉作為氮源，最佳接種量為5%，最適pH 7.0。結果表明，蛋白胨或豆粕粉作為氮源，最佳發酵pH值均為pH 7.0左右，沒有差異。以蛋白胨作為氮源，當蛋白胨添加量為1%時，最佳接種量為3%(比值為1∶3)，當添加量升高到2%時，最佳接種量為5%(比值為2∶5)。本研究3%豆粕粉作為氮源，最佳接種量為5%(比值為3∶5)，因此，豆粕粉與蛋白胨作為氮源相比，接種量要高。在后續的工業化發酵生產的實踐中，如果以豆粕粉為氮源，應當適當增加接種量。

在搖瓶水平確定了最佳豆粕粉添加量和系列工藝參數的基礎之上，又進一步在小試與中試發酵規模進行了驗證和放大，7 L發酵罐水平納豆激酶活性高達6 717 IU/mL，200 L中試發酵罐水平納豆激酶活性可達4 236 IU/mL。因此，本研究以價格低廉的豆粕粉為發酵原料不僅降低了生產成本，而且大幅度升高了發酵液中的納豆激酶活性，并且在豆粕粉作為氮源的基礎之上優化了系列的發酵參數與工藝，實現了從搖瓶水平到中試水平的工藝驗證與放大。為枯草芽孢桿菌產業化生產納豆激酶用于食品和藥物開發提供了廉價的原料選擇和可靠的發酵工藝。

[1] 中國居民營養與慢性病狀況報告(2015)[M]. 北京：中國衛生與計劃生育委員會， 2015.

[2] 李章立. 心腦血管疾病的防治與養生[C].中華中醫藥學會血栓病分會第七次學術研討會.中華中醫藥學會血栓病分會第七次研討會暨河北省中醫藥學會健康營養藥膳專業委員會學術會議論義集，河北邯鄲，中華中醫藥學會，2013：487.

[3] UEDA M, KUBO T, MIYATAKE K, et al. Purification and characterization of fibrinolytic alkaline protease fromFusariumsp. BLB[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2007, 74(2):331-338.

[4] SUMI H, HAMADAH, TSUSHIMA H, et al. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia, 1987, 43(10):1 110-1 111.

[5] KOU W, ZHANG Y N, XIN R, et al. Application of nattokinase in health drinks and its prospects[J]. Beverage Industry, 2006, 9(8):9-11.

[6] FUJITA M, NOMURA K, HONG K, et al. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (Nattokinase) in the vegetable cheese Natto, a popular soybean fermented food in Japan[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 1993, 197(3):1 340-1 347.

[7] URANO T, IHARA H, UMEMURA K, et al. The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT purified fromBacillussubtilisCleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type 1.[J]. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(27):24 690-24 696.

[8] FUJTIA M, OHNISHI K, TAKAOKA S, et al. Antihypertensive effects of continuous oral administration of nattokinase and its fragments in spontaneously hypertensive rats.[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2011, 34(11):1 696-1 701.

[9] JANG J Y, KIM T S, CAI J M, et al. Nattokinase improves blood flow by inhibiting platelet aggregation and thrombus formation[J]. Laboratory Animal Research, 2013, 29(4):221-225.

[10] FUJITA M, HONG K, ITO Y, et al. Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat.[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 1995, 18(10):1 387-1 391.

[11] XU J, DU M, YANG X, et al. Thrombolytic effects in vivo of Nattokinase in a carrageenan-induced rat model of thrombosis[J]. Acta Haematologica, 2014, 132(2):247-253.

[12] YAN F, YAN J, SUN W, et al. Thrombolytic effect of Subtilisin QK on carrageenan induced thrombosis model in mice[J]. Journal of Thrombosis & Thrombolysis, 2009, 28(4):444-448.

[13] LEE D L, HONG S Y, JANG Y S, et al. The evaluation of antithrombotic and fibrinolytic activities of nattokinase fromBacillussubtilisnatto[J]. Physics of Plasmas, 2012, 27(6):375-380.

[14] 張利, 成子強, 李培鋒, 等. 納豆激酶溶血栓作用的研究[J]. 山東農業大學學報(自然科學版), 2005,36(4):625-631.

[15] TAI M W, SWEET B V. Nattokinase for prevention of thrombosis[J]. American Journal of Health-System Pharmacy, 2006, 63(12):1 121-1 123.

[16] HSIA C H, ShEN M C, LIN J S, et al. Nattokinase decreases plasma levels of fibrinogen, factor VII, and factor VIII in human subjects[J]. Nutrition Research, 2009, 29(3):190-196.

[17] SUMI H, HAMADA H, Nakanishi K, et al. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase[J]. Acta Haematologica, 1990, 84(84):139-143.

[18] YUKO K, SHINSUKE N, TOSHIYUKI H, et al. A single-dose of oral nattokinase potentiates thrombolysis and anti-coagulation profiles[J/OL]. Scientific Reports, 2015, 5[2016-09-09]. http://www.nature.com/articles/srep11601 DOI: 10.1038/srep11601.

[19] ERO M P, NG C M, MIHAILOVSKI T, et al. A pilot study on the serum pharmacokinetics of nattokinase in humans following a single, oral, daily dose[J]. Alternative Therapies in Health & Medicine, 2013, 19(3):16-19.

[20] LAMPE B J, ENGLISHI J C. Toxicological assessment of nattokinase derived fromBacillussubtilis, var. natto[J]. Food & Chemical Toxicology, 2015, 88:87-99.

[21] 胡景柱, 夏壽華, 吳林. 納豆凍干粉的安全性研究[J]. 安徽農業科學, 2000, 28(3):380-381.

[22] 黃曉曼, 楊鵲, 邱志健,等. 納豆激酶的安全性試驗[J]. 中國食品添加劑, 2008(2):109-112.

[23] 付玉生, 李永利, 張焱,等. 納豆激酶膠囊毒理學安全性評價[J]. 實用預防醫學, 2012, 19(11):1 714-1 716.

[24] 張琳, 王凱, 龐豐平,等. 納豆激酶的液體發酵條件優化[J]. 基因組學與應用生物學, 2016(2):373-377.

[25] 任武賢, 王星星, 戴東升. 納豆激酶液態發酵工藝的優化[J]. 大豆科學, 2015, 34(1):128-130.

[26] 熊曉輝, 梁劍光, 熊強. 納豆激酶液體發酵條件的優化[J]. 食品與發酵工業, 2004, 30(1):62-66.

[27] 王萍, 杜連祥, 路福平,等. 溶栓納豆芽孢桿菌的篩選鑒定及產納豆激酶條件的研究[J]. 食品與發酵工業, 2006, 32(2):74-77.

[28] CONG W, MING D, ZHENG D, et al. Purification and characterization of Nattokinase fromBacillussubtilisNatto B-12[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2009, 57(20):9 722-9 729.

[29] 許強, 薛建. 納豆激酶液體發酵培養基優化研究[J]. 北京農業, 2014(33):32-33.

[30] 張鋒, 金杰, 安瑩, 等. 納豆激酶液體發酵條件的優化研究[J]. 食品與發酵科技, 2005, 41(4):22-25.

[31] 張立, 趙友云, 馬強, 等. 枯草桿菌溶栓酶QK-2發酵工藝的優化及其腸溶膠囊的研制[C]. 湖北生物產業發展高端論壇暨湖北省生物工程學會2012年度學術交流會, 2012年湖北生物產業發展高端論壇暨湖北省生物工程學2012年度學術交流會論文匯編，湖北武漢，湖北省科學技術協會，2012.

Process optimization and validation ofBacillussubtilisliquid fermentation for nattokinase production using soybean cake powder as the nitrogen source

DONG Yan-shan1, Gao Li2,HE Jia-heng2, HU Biao-qun2,FAN Qing-yun2, WANG Ye-fu1*

1(Wuhan University, College of Life Science, State Key Laboratory of Virology, Wuhan 430075,China)2(Wuhan Zhenfu Pharmaceutical Co. Ltd, Wuhan 430075,China)

Tryptone was selected as the nitrogen source in traditionalBacillussubtilisliquid fermentation, which led to high production costs and low nattokinase activities. In this study, tryptone was replaced with low-cost soybean cake powder as the nitrogen source inBacillussubtilisliquid fermentation to produce nattokinase.The amountof soybean cake powder, the optimal inoculum size, media initial pH and fermentation time were confirmed after optimization at shake flask level. The nattokinase activities in shake flask level arrived at 5 471 IU/mL, which was 3.6 times of that from fermentation with same amount of tryptone as nitrogen source. The above parameters at shake flask fermentation level were further verified in 7 L and 200 L fermentation tank, and the optimal dissolved oxygen level was confirmed to be 30%. The nattokinase activities in 7 L and 200 L fermentation tank respectively reached 6 717 IU/mL and 4 236 IU/mL.

soybean cake powder;Bacillussubtilis; nattokinase; fermentation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702019

博士，助理研究員(王業富教授為通訊作者,E-mail：wangyefu@whu.edu.cn)。

中國博士后科學(2016M592375)；湖北省衛計委青年人才項目(WJ2017Q002)

2016-09-09，改回日期：2016-10-14