紅茶菌A4發酵功能飲料的研制

孫玉坤，李亞霖，趙亮，籍保平，周峰

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院，植物源功能食品北京市重點實驗室，北京，100083)

紅茶菌A4發酵功能飲料的研制

孫玉坤，李亞霖，趙亮，籍保平，周峰*

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院，植物源功能食品北京市重點實驗室，北京，100083)

以紅茶茶湯(質量分數0.5%)、蜂蜜(質量濃度6.54%)作為發酵底物，接種本課題組前期分離純化，并擁有知識產權的紅茶菌葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp., A4)10%進行發酵，而研發出一款新的功能性飲料。這株菌代謝產出具有保肝護肝功效的功能因子D-葡萄糖二酸-1,4-內酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone monohydrate, DSL)。靜置于30 ℃環境下4～5 d得到發酵液，再將發酵液經離心、抽濾、調配、罐裝、密封、殺菌等一系列工序，制成有功能性和獨特風味的、可以進行工業生產的飲料。經過感官評價確定最終飲料配方為：87.35%發酵原液，12.24%白砂糖，0.16%檸檬酸，0.25%蘋果酸。最終通過抗氧化能力的測定，與市售紅茶菌發酵飲料進行比較，評定本產品的抗氧化性最佳。

紅茶菌；發酵；功能飲料；抗氧化

紅茶菌發酵飲料大多以家庭自制為主，市面上鮮有成功產品，其菌株均為混合菌株，由醋酸菌、酵母菌、乳酸菌等多種菌種共同組成，將原料經過生物技術發酵工藝后，代謝產生營養物質，具有一定的保健功能[4]，并賦予產品酸甜相宜、清香爽口的風味[1]。紅茶菌是歷史悠久的酸性保健飲料，其起源可以追溯到我國古代秦朝時期，但目前紅茶菌的研究多在菌種分離鑒定、代謝產物鑒定以及紅茶菌抑菌特性上，對紅茶菌應用的研究較少[2]，而本實驗恰為紅茶菌研發出新型的飲料。本實驗選用的菌種是從紅茶菌混合菌株中分離出來的一種單一菌株——葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp., A4)，該菌株經過代謝途徑特異性高產功能因子D-葡萄糖二酸-1,4-內酯(D-saccharic acid 1,4-lactone monohydrate, DSL)。DSL的保肝護肝功能已被證實，MICHAEL等人在1996年便提出紅茶菌的解毒抗癌作用可能是因為紅茶菌液中存在DSL[4]，在KIM等人的研究中提出，0.03～0.15 mg/mL的DSL具有顯著的解毒、抗癌作用[3]，特別是預防和治療癌癥方面，對癌癥早期具有良好效果[19]。因此，紅茶菌A4菌株發酵飲料的研發和其投入工業化生產具有廣闊的前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純蜂蜜，蕊悅同仁堂市售；云南滇紅紅茶，北京吳裕泰茶葉股份有限公司專賣店售；葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp., A4)，保藏于中科院微生物菌株保藏中心(專利號：ZL 2004 1 0091488.X)；食品級碳酸鈣，河南思遠生物科技有限公司；食品級酵母抽提物，唐山拓普生物科技有限公司；食品級檸檬酸、食品級DL-蘋果酸，北京易秀博谷生物科技有限公司；白砂糖，北京閩松經貿有限公司；甲醇(高效氣相色譜用)(Methanol)，西隴化工股份有限公司；D-葡萄糖二酸1,4-內酯(D-saccharic acid 1,4-lactone monohydrate)，美國Sigma公司。

對比樣品：樣品A：自主研發產品，紅茶菌A4菌種發酵，常溫存放至少6個月以上；樣品B：紅茶菌混合菌株發酵飲料，市售，貨架期較長，為12個月，常溫保存；樣品C：紅茶菌混合菌株發酵飲料，市售，貨架期較短，為15 d，需0～7 ℃冷藏；樣品D：紅茶菌混合菌株發酵飲料，市售，聲稱內含野生沙棘。

1.2 儀器與設備

全自動殺菌釜MLS-3020，日本三洋電器有限公司；雙人單面凈化工作臺SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司；生化培養箱LRH-250，上海一恒科技有限公司；水浴振蕩器HZS-H，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；高速臺式離心機TDL-5-A，北京市長風儀器儀表公司；Softmax Pr，MD酶標儀SMP500-15275-SWXN， MD, Enterprise；糖度計LB80，廣州市銘睿電子科技有限公司；氣相色譜儀GC-2010，日本島津公司；一次性使用無菌注射器1ML 20140408，江蘇治宇醫療器材有限公司；微孔濾膜(有機/尼龍66)0.22 μm，津隆。

1.3 方法

1.3.1 菌種的馴化與發酵條件

種子液的制備：先配制液體培養基，4 g葡萄糖(100 g/L)，0.4 g酵母浸出物(10 g/L)，0.8 g CaCO3(20 g/L)，純凈水40 mL，全部使用食品級試劑，pH調制6.8[5]。滅菌后晾涼，在超凈工作臺中用接種環從斜面接3～4環至液體培養基中。置于30 ℃水浴振蕩器中振蕩培養24 h，待接種至第1次擴大培養液，接種量為20%。

第1次與第2次擴大培養：先進行培養液的配制，3.0 g紅茶(每升基液應稱取5 g)，用煮沸的純凈水浸泡3次，每次15 min，最后將3次茶湯混合，共600 mL(第1次擴大培養液用80 mL，第2次擴大培養液用320 mL)制成0.5%紅茶茶湯。再加入蜂蜜并溶解，蜂蜜固形物含量為76.4% Bx，加入量為65.4 g/L(根據紅茶菌糖利用率最高的情況確定)，故稱取39.27 g。滅菌備用。第1次與第2次擴大培養各置于30℃水浴振蕩器中振蕩培養24 h，從第1次擴大培養液接種至第2次擴大培養液中的接種量也為20%。

發酵條件：發酵基液的配制與第1、2次擴大培養液相同，稱取15.0 g紅茶，用煮沸的純凈水浸泡3次，每次15 min，最后將3次茶湯混合，共3 L紅茶茶湯，加入196.34 g蜂蜜并溶解，從中取2.7 L發酵基液滅菌備用。從第2次擴大培養液中接種至基液，接種量為10%，靜置于30 ℃恒溫環境中發酵8 d，并隔天取樣(第0、2、4、6、8天)。樣品于-80 ℃下保存待測。

1.3.2 滅菌條件

使用高壓滅菌釜，121 ℃，15 min。

1.3.3 DSL的測定氣相色譜條件

標準品配制：準確稱取DSL 100.000 0 mg，并用甲醇定容至10 mL容量瓶中，得到濃度為10 000 g/L。從上述溶液中取5、2、1、0.5、0.1 mL，各自定容至10 mL容量瓶中，得到濃度分別為5 g/L、2 g/L、1 g/L、0.5 g/L、0.1 g/L的標準品。

樣品前處理：取第4天、第8天樣品的1號、2號、3號于離心管中3 000 g、15 min離心，取上清液1 mL至干燥小燒杯中，在鼓風干燥箱中以85 ℃烘干，再分別用4 mL甲醇溶解，封口膜密封。將溶液倒入7 mL離心管中3 000 g、15 min離心，再用一次性無菌注射器將上清液吸出于4 mL離心管中，使之通過0.22 μm的濾膜。標記好后放置在-20 ℃下保存待測。

色譜柱：J&W DB-WAX毛細管色譜柱(30 m×0.250 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度50 ℃保持1 min，以12 ℃/min升至220 ℃，保持8 min；載氣(N2)流速1.2 mL/min，壓力2.4 kPa，進樣量1.0 μL；分流比：1∶10。

1.3.4 總糖的測定

蒽酮比色法。

1.3.5 總酸的測定

電位滴定法。

1.3.6 感官評價

選擇消費者型感官鑒評人員，做嗜好性感官評價分析，選取的鑒評人員需要自愿進行試飲，身體健康，具有一定語言表達能力，對試樣持客觀態度[7]。研發者先對正交的實驗樣品進行試飲，選出5款最有可能被大眾所接受的配方，再對這5款飲料進行感官評價。盛裝器皿無特殊標記，編號隨機且無含義，分發評價標準和評價表，以產品的氣味、色澤、風味、形態作為評分依據，以具有獨特的產品風味、色澤均一、無雜質、澄澈透明、風味酸甜適宜為評分標準，權重比例算得最高分者作為產品的最終配方。

表1 紅茶菌A4發酵保肝功能性飲料感官評價評分細則

1.3.7 抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除率測定

參照丁艷如等[18]的方法，稍作修改。加入樣品2 mL、0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL于5 mL帶蓋離心管中，混勻，用錫紙包裹，反應30 min，在517 nm下用酶標儀測定吸光度值。

DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：Ai為加入DPPH和2 mL甲醇測得的吸光度值；Am為加入DPPH和樣品測得的吸光度值；An為加入樣品和2 mL甲醇測得的吸光度值。

1.3.7.2 超氧陰離子(·O2-)清除率測定

參照丁艷如等[18]的方法，稍作修改。加入0.05 mol/L(pH 8.2)的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于10 mL帶蓋離心管中，25 ℃下保溫10 min，加入樣品1 mL、6 mmol/L的鄰苯三酚0.4 mL，混勻，靜置反應4 min后，加入8 mol/L的HCl溶液1 mL終止顯色反應，在320 nm下用酶標儀測定吸光度值。

·O2-清除率計算公式為：

式中：Ad為蒸餾水代替樣品時測得的吸光度值；Ap為樣品測得的吸光度值；Aq為蒸餾水代替鄰苯三酚時測得的吸光度值。

1.3.7.3 羥基自由基(OH·)清除率測定

參照丁艷如等[18]的方法，稍作修改。加入樣品1mL、9mmol/LFeSO4溶液1mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液于帶蓋離心管中，最后加入8.8mmol/LH2O2溶液1mL啟動整個體系，在37 ℃下反應30min，在512nm下用酶標儀測定吸光度值。

OH·清除率計算公式為：

式中：Ak為蒸餾水代替樣品測得的吸光度值；Ax為樣品測得的吸光度值；Ay為蒸餾水代替H2O2時測得的吸光度值。

1.4 工藝優化試驗說明

成品需經過圖1的主要工藝流程制得。首先獲得A4菌種，進行菌種馴化，配制種子液和兩次擴大培養液，每階段均在30 ℃水浴中振蕩培養24 h，各階段間接種量為20%，隨后以10%的接種量接種至基液中。基液中紅茶質量濃度為0.5%、蜂蜜為6.54%，接種后于30 ℃環境下靜置培養4～5 d得到發酵液，再將發酵液經離心、抽濾、調配、罐裝、密封等一系列工序，制成有功能性和獨特風味的、可進行工業生產的飲料。經過感官評價確定最終飲料配方為：87.35%發酵原液，12.24%白砂糖，0.16%檸檬酸，0.25%蘋果酸。

結果顯示DSL的濃度是隨發酵時間而逐漸增加的，即發酵后第8天的功能因子濃度比第4天大，而出于感官因素舍棄了第8天的樣品。第8天的樣品已呈現出發酵的腐敗氣味，口感酸味過重，蜂蜜風味較淡，而第4～5天樣品既有清新的風味，又有酸甜適宜的口感，且未出現不正常味道。

圖1 主要工藝流程Fig.1 The main process flowchart

2 結果與分析

2.1 總糖含量

發酵過程中，紅茶菌A4菌株對葡萄糖的消耗與培養時間呈線性相關(R2≥0.9)[8]，并且紅茶菌的發酵主要在前4天完成，多酚含量、糖度、pH都會明顯下降，菌體大量繁殖，耗糖量大，酸度增高[8]。8天發酵過程中總糖含量的變化呈明顯的線性關系(R2≥0.99)。

圖2 發酵8天內總糖變化趨勢Fig.2 Result of total sugar

紅茶菌利用發酵液中的糖類物質，產生各種酸、風味物質以及功能因子DSL，所以總糖隨發酵時間的延長而總體呈下降趨勢。

2.2 總酸含量

發酵液中的總酸含量隨著發酵時間的增加而增加，經品嘗，發酵到第4～5天時酸度比較適口，而發酵時間繼續延長則會產生一些其他的代謝產物，使得其口味發生不良變化。

圖3 發酵8天內總酸變化趨勢Fig.3 Result of total acid

微生物發酵分解葡萄糖、果糖等碳水化合物，經過2個代謝途徑，產生了各種不同的酸性物質，使得發酵液整體呈酸性。一方面賦予了產品酸味，另一方面提高了產品的保藏性能。

2.3 功能因子DSL含量

能夠代謝產生較多功能因子DSL的菌株較少，而A4菌株正是其中之一，A4菌株代謝葡萄糖(主要)的途徑是葡萄糖——葡萄糖醛酸——葡萄糖二酸——葡萄糖二酸1,4-內酯，而次要的途徑為糖酵解途徑(Embden-Meyerhof-Parnaspathway，EMP)，生成丙酮酸，再氧化生成乙酸[9]。

表2 氣相色譜標準品數據

表3 發酵8 d內功能因子DSL及感官變化

通過氣相色譜法對樣品中的DSL進行分離測定，根據峰面積及標準品曲線，確定不同發酵天數的樣品中所含有的DSL濃度，綜合其口味及DSL含量，最終確定第4天為發酵終點也是發酵的最佳時間。

2.4 配方分析與感官評價

對發酵終止后的產品進行可溶性固形物、總酸的測定，測得第4～5天時發酵液的可溶性固形物含量為5%，總酸含量為2.953 8 g/L，糖酸比約為5∶3。

為使產品口感酸甜可口，添加白砂糖作為甜味劑，檸檬酸和蘋果酸作為酸味劑進行復配，以增強口感豐富度，強化風味。由于檸檬酸(閾值為0.1%～1.0%)的酸感強烈，但是持久性差；而蘋果酸的口感較為柔和，回味持久，故兩者復配后可得到較為適中的口味，比例為2∶3較為適宜[12-13]。

經過10位接受感官評價的評分者對不同配方飲料的品嘗及打分，按權重比例算得最高分的組別為第4組配方，評分結果如下。

表4 五種不同配方的添加劑添加量與感官評價結果

表5 紅茶菌A4發酵功能性飲料配料表

2.5 抗氧化活性評價

將自主研制的紅茶菌A4發酵飲料與其他3種市售紅茶菌發酵飲料進行了抗氧化活性方面的功能比較。

樣品A：自主研發產品，紅茶菌A4菌種發酵，實驗時已在常溫存放至少6個月，滋氣味與外觀均未發生改變，顏色最深，深褐色。

樣品B：紅茶菌混合菌株發酵飲料，市售，貨架期較長，為12個月，常溫保存，310 mL塑料瓶包裝，不透明，入口后酸味刺激，回味甜，顏色居中，褐色，實驗時已有5個月貨架期，形態仍比較穩定，未見異常；

樣品C：紅茶菌混合菌株發酵飲料，市售，貨架期較短，為15 d，需0～7 ℃冷藏，300 mL玻璃瓶包裝，存放6 d左右后瓶內出現菌膜，略有異味，味道加酸，顏色最淺，淺褐色，飲料中含氣，形態不穩定。

樣品D：紅茶菌混合菌株發酵飲料，市售，聲稱內含野生沙棘，1 000 mL玻璃瓶包裝，瓶內含有黃色懸浮物，會掛在液面處的玻璃瓶內壁，顏色居中，褐色。

2.5.1 DPPH清除能力

從圖4中可以看出，4種紅茶菌發酵飲料均對DPPH自由基具有較強的清除能力，各樣品的清除率均在90%以上。其中自主研發的DPPH自由基清除率雖未名列第一，但是經過Tukey數據分析，各個樣品間差異并不顯著，說明從各個樣品的DPPH 自由基清除率并不能比較出哪種產品抗氧化性更好。

圖4 DPPH自由基清除能力測定Fig.4 The measurement of Scavenging activity on DPPH free radical

Tukey'smultiplecomparisonstestMean1Mean2MeanDiff.95%CIofdiff.SignificantSummaryAvs.B0.92260.9397-0.01713-0.1258to0.09155NonsAvs.C0.92260.9355-0.01290-0.1216to0.09579NonsAvs.D0.92260.9863-0.06373-0.1724to0.04496NonsBvs.C0.93970.93550.004236-0.1044to0.1129NonsBvs.D0.93970.9863-0.04660-0.1553to0.06209NonsCvs.D0.93550.9863-0.05083-0.1595to0.05785Nons

2.5.2 超氧陰離子清除能力

圖5 超氧陰離子清除能力測定Fig.5 The measurement of scavenging activity on ·O2-

Tukey多因素檢測Mean1Mean2MeanDiff.95%CIofdiff.Significant?SummaryAvs.B0.72340.47250.25080.2064to0.2953Yes****Avs.C0.72340.67840.044990.0005412to0.08943Yes*Avs.D0.72340.58860.13480.09033to0.1792Yes****Bvs.C0.47250.6784-0.2058-0.2503to-0.1614Yes****Bvs.D0.47250.5886-0.1160-0.1605to-0.07160Yes***Cvs.D0.67840.58860.089790.04535to0.1342Yes***

2.5.3 羥基自由基清除能力

從圖中6可看出，樣品A的OH·清除率最高，可達95%以上，高于其他3個樣品；其中樣品B的OH·清除能力最弱，低于50%。根據Tukey數據分析，樣品A與樣品B間存在顯著性差異，與樣品C及樣品D間差異不顯著。說明，自主研發的產品的OH·清除能力優于樣品B但與樣品C和樣品D無可比性。

圖6 羥基自由基清除能力測定Fig.6 The measurement of Scavenging activity on OH·

Tukey'smultiplecomparisonstestMean1Mean2MeanDiff.95%CIofdiff.Significant?SummaryAvs.B0.96640.43240.53400.3761to0.6919Yes****Avs.C0.96640.85720.1092-0.04872to0.2671NonsAvs.D0.96640.91140.05502-0.1029to0.2129NonsBvs.C0.43240.8572-0.4248-0.5827to-0.2669Yes***Bvs.D0.43240.9114-0.4790-0.6369to-0.3211Yes****Cvs.D0.85720.9114-0.05417-0.2121to0.1037Nons

3 結論

以紅茶茶湯(質量分數0.5%)、蜂蜜(質量分數6.54%)作為發酵底物，課題組分離的紅茶菌葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobactersp., A4)10%進行發酵，靜置于30 ℃環境下4～5 d得到發酵原液。發酵液較發酵前溶液總糖減少，總酸增加、pH降低，菌株代謝產出已證實具有功能因子D-葡萄糖二酸1,4-內酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone monohydrate, DSL)，并經氣相色譜儀定性定量測得濃度為0.390 mg/mL，為有效濃度范圍內。發酵原液在經離心、抽濾、調配、罐裝、密封、殺菌、感官評價等一系列工序后，用87.35%發酵原液、12.24%白砂糖、0.16%檸檬酸、0.25%蘋果酸配制成產品。成品不僅具有原料蜂蜜及紅茶風味，還有獨特的發酵風味，口感酸甜可口，味道醇厚飄香，還具有一定的保健功效，并可以進行工業生產。

[1] 王春霞.紅茶菌棗飲料的研制及副產物的利用[J].食品工業科技,2006, 27(10): 126-128.

[2] 吳燕,阮暉,何國慶.紅茶菌的研究和應用進展[J].食品工業科技,2012, 33(8):436-438.

[3] KIM D H, JINY H, JUNG EA et al.Purification and characterization of beta-glucuronidase fromEscherichiacoliHGU-3,a human intestinal bacterium[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin,1995,18(9):1 184-1 188.

[4] 朱曉慶,陳義倫,張亞偉,等.紅茶菌發酵過程中抗氧化能力的變化規律[J].食品與發酵工業,2010,36(11):111-114.

[5] 田文禮,籍保平,李博,等.HPLC法檢測紅茶菌中葡萄糖代謝曲線及培養基的優化研究[J].食品科學,2004, 25(2):161-163.

[6] 李曉旭,李家政.優化蒽酮比色法測定甜玉米中可溶性糖的含量[J].保鮮與加工,2013,13(4):24-27.

[7] 韓北忠,童華榮,杜雙奎.食品感官評價[M].第二版.北京:中國林業出版社, 2016: 212-231.

[8] 任亮.紅茶菌發酵工藝的研究[D].合肥:安徽農業大學,2013.

[9] 吳薇.紅茶菌菌種主要代謝產物的試驗研究[J].食品科學,2004, 25(12):147-151.

[10] 李杏,孟岳成,陳杰,等.發酵型蘋果醋飲料的開發及其感官評價[J].中國調味品,2012,37(6):76-88.

[11] 張鐵,王偉偉,王國宇,等.基于感官評價研制紅茶固體飲料的研究[J].福建茶葉,2014,36(3):13-15.

[12] 侯偉.酸味劑的種類及應用[J].農村新技術,2009(24):25-26.

[13] 陳文偉,陳鋼.甜味劑的應用和發展[J].江西食品工業,2002(4):27-28.

[14] 姜文,于帆.產品設計評價中感官評價方法的應用研究[J].中國科技信息,2012(12):198-211.

[15] KAHAN J S,GIBBS J N.Food and drug administration regulation of medical device biotechnology, and food and food additive biotechnology[J].Applied Biochemistry & Biotechnology,1985,11(6):507-516.

[16] MIGUEL G R,BANOS L,RODRIGUEZ-GARCIA M E.Lime characterization as a food additive[J].Sensing and Instrumentation for Food Quality and Safety,2007,1(4):169-175.

[17] FRANK G W. A smattering of quotes by various Kombucha users.[EB/OL].1999[2016-06-05].http://www.kombu.de/ testimon.htm.

[18] 丁艷如,陳爽,朱忠順,等.紅茶菌的發酵條件及抗氧化活性[J].食品科技,2016,41(3):21-26.

Development on functional fermented beverage with Kombucha A4

SUN Yu-kun, LI Ya-lin, ZHAO Liang, JI Bao-ping, ZHOU Feng*

(Beijing Key Laboratory of Functional Food from Plant Resources, College of Food Science & Nutritional Engineering,China Agricultural University, Beijing, 100083, China)

In this study, 0.5% (mass concentration) black tea and 6.54% (mass concentration) honey (with soluble solids content of 76.4%) were used as substrate to fermentGluconacetobactersp., A4, a strain of Kombucha separated and purified in our laboratory earlier, at inoculum concentration of 10% to develop a new kind of functional beverage. Kombucha could produce functional factor with liver-protecting effect named D-Saccharic acid 1,4 lactone monohydrate (DSL). The beverage with unique flavor and taste was obtained after fermentation at 86 ℉ for about 4-5 days. The fermented liquid was centrifuged, filtrated, mixed, filled into bottle, sealed, and sterilized to obtain industrial product. After sensory evaluation, the final formula of the beverage was determined as follows: 87.35% fermented liquid, 12.24% sugar, 0.16% citric acid and 0.25% malic acid. Finally, compared with three commercially available Kombucha beverages, our product has the highest resistance tooxidation.

kombucha; fermentation; functional beverage; oxidation resistance

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702025

本科(周峰副教授為通訊作者，E-mail：zf@cau.edu.cn)。

2016-08-08，改回日期：2016-10-19