蘋果醋飲料中的有機酸分析

李曦，陳倩，唐偉，仲伶俐，付成平，楊曉鳳*

1(四川省農業科學院分析測試中心，四川 成都，610066) 2(中國綠色食品發展中心，北京，100081)

蘋果醋飲料中的有機酸分析

李曦1，陳倩2，唐偉2，仲伶俐1，付成平1，楊曉鳳1*

1(四川省農業科學院分析測試中心，四川 成都，610066) 2(中國綠色食品發展中心，北京，100081)

建立蘋果醋飲料中9種有機酸的分離檢測方法并對20種不同品牌的蘋果醋飲料樣品進行分析。色譜柱：Waters sunfire C18；流動相：0.01 mol/L (NH4)2HPO4(pH 3.0)；柱溫：35 ℃；流速：0.9 mL/min；檢測波長：200 nm。在優選的色譜條件下9種有機酸(草酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、馬來酸、乳酸和琥珀酸)得到良好分離，每個樣品均含有5種以上有機酸，最多可達到7種。樣品各自的有機酸總量可達到3.0～8.0 g/kg，平均含量5.6 g/kg，以檸檬酸、蘋果酸、乙酸平均含量較高，分別可達到2.66、1.7、1.1 g/L。20個樣品中只有2個樣品(原汁發酵產品)符合GB/T30884《蘋果醋飲料》中對總酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸含量的要求，絕大部分產品的蘋果酸和檸檬酸含量超出標準要求。

蘋果醋；有機酸；反相高效液相色譜

蘋果醋是近年興起的一種健康飲品，是以新鮮蘋果或蘋果汁為原料發酵成乙醇，然后接入醋酸菌種，兩次發酵代謝的物質具有的酯香和蘋果汁特有的果香融合在一起，進而調配出不同酸度的飲料[1]。市面上的蘋果醋主要有蘋果醋飲料和蘋果醋調味品2種產品類型。蘋果醋調味品總酸含量比蘋果醋飲料高，主要用于食品調味，國外的此類蘋果醋消費量很大[2]。蘋果醋飲料是以蘋果醋、果汁、水為原料加入其他調味劑制成的飲料，成本低而營養價值高，兼具調節血壓、增強消化功能、減肥等功效[3]，是我國20世紀90年代新起的繼碳酸飲料、飲用水、果汁和茶飲料之后的“第四代”飲料。蘋果醋飲料的酸味是其特征感官指標，其酸味質量體現在有機酸的含量和組成上。蘋果醋飲料中含有大量的有機酸，除了揮發性酸乙酸外，還含有大量乳酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、草酸、蘋果酸等不揮發酸[4]。這些有機酸決定了果醋的酸味質量，尤其是蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸能夠緩沖乙酸的刺激性，使其酸味更加柔和、醇厚，并賦予特色的酸味[5-6]，這對于風味較淡的蘋果醋產品質量尤為重要。

有機酸組成和含量決定了蘋果醋飲料的口感和營養，為了了解市場上的蘋果醋飲料的酸味質量，作者對市面上20種不同品牌蘋果醋中的9種有機酸進行了檢測，包括草酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、馬來酸、乳酸和琥珀酸。目前測定有機酸的方法有氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法等。氣相色譜法需衍生處理，操作繁瑣，準確度較低；離子色譜法多采用稀強酸，如稀鹽酸和稀硫酸作淋洗液，對設備有一定腐蝕作用[8-9]。本文采用高效液相色譜法分析有機酸可以克服上述不足之處，并可同時檢測多種有機酸，操作簡易重復性強。趙芳等[10]用高效液相色譜方法對蘋果醋中的5種有機酸進行分析，分析的有機酸種類較少且分析時間長(14 min)，并且檸檬酸分離度不佳；李俶等[11]對南酸棗及棗糕中的7種有機酸進行分析，前處理方法較復雜，需過固相萃取小柱，且乳酸和乙酸分離度不佳；陳義倫等[12]對原汁蘋果醋中的7種有機酸進行分析，分析時間合適(9 min)，但據樣品圖譜反映有機酸分離不佳，定量準確度不高。上述及相關文獻都存在樣品量少，有機酸種類少，且分離度有待提高的問題。

本文旨在建立一種簡單高效的有機酸檢測方法：前處理簡便、各有機酸的分離度滿足需求、總的分離時間短，以對市場上20種不同品牌蘋果醋飲料中的9種有機酸進行分析，并將檢測到的有機酸結果與國標GB/T30884《蘋果醋飲料》[7]中的有機酸指標相比照，探究市場上蘋果醋飲料與標準的符合程度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20種不同品牌的蘋果醋飲料從成都各大超市購得。

H3PO4(色譜純)，天津科密歐化學試劑公司；(NH4)2HPO4(分析純)，阿拉丁試劑；草酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、琥珀酸標準品，德國DR公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1100高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 有機酸標準溶液配制

稱取草酸0.125 g、酒石酸0.563 g、蘋果酸1.000 g、乳酸1.000 g、乙酸1.000 g、馬來酸0.031 g、檸檬酸1.000 g、富馬酸0.031 g、琥珀酸1.000 g至25 mL容量瓶中，用超濾水定容至刻度配制成混標儲備液。混標中上述各標準品的濃度分別為5.0、22.5、40.0、40.0、40.0、1.25、40.0、1.25、40.0 mg/mL。分別量取混標溶液0.02、0.1、0.2、4.0、10.0 mL定容至100 mL容量瓶中，用0.45 μm濾膜過濾后，得到不同濃度的有機酸混合標準品工作液。

1.3.2 樣品前處理[7]

取5.00 mL蘋果醋飲料樣液于10 mL容量瓶中，加入0.2 mL 1 mol/L的H3PO4，用蒸餾水定容，經0.45 μm濾膜過濾，過濾液待上機。

1.3.3 色譜條件[13]

色譜柱：Waters sunfire C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：0.01 mol/L (NH4)2HPO4，用1 mol/L H3PO4調至pH=3.0；流速：0.9 mL/min；進樣量：10 μL；紫外檢測器波長：200 nm。

2 結果與分析

2.1 色譜柱選擇

對以下3種色譜柱的分離效果進行了比較：Waters sunfire C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Thermo hypersil gold C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Zorbax SB-AQ柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。9種有機酸在上述色譜柱中都能出峰，但Thermo色譜柱分離度不佳，草酸和酒石酸不能完全分開；Zorbax柱的分離時間過長，且部分峰形對稱性不好。3種色譜柱中以Agilent sunfire C18柱的分離效果最佳：各有機酸的分離度好，峰形較對稱，且出峰時間快，總的分離時間控制在10 min以內。3種色譜柱柱子規格和填充物粒徑大小都一樣，2個C18柱具有相同的鍵合相，或因不同廠家的鍵合基質和鍵合技術的差異導致性能的差異，而Zorbax SB-AQ具有親水性的表面，因而保留作用比許多傳統的C18色譜柱要強從而導致出峰時間過長。因而實驗采用Waters sunfire C18柱對9種有機酸進行色譜分析。

2.2 流動相選擇

比較KH2PO4、HCl和(NH4)2HPO4作為流動相緩沖鹽的分離效果，固定流動相的緩沖鹽濃度為0.01 mol/L，流速為0.9 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長200 nm，Agilent sunfire C18為色譜柱，對有機酸混合標液進行測定，其中草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸的濃度分別為10、45、80、80、80、2.5、80、2.5、80 μg/mL。

圖1 不同溶劑作流動相時的標樣和樣品圖譜Fig.1 The chromatograms of standards and samples using different solvents as the mobile phase

結果表明，以HCl作流動相(圖1-A)，蘋果酸、乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸5 種有機酸的分離度較好，但草酸和酒石酸的分離度不好，琥珀酸和富馬酸峰形也有重疊；以KH2PO4為流動相(圖1-B)草酸和酒石酸的分離度不佳，且馬來酸峰形有拖尾現象；以(NH4)2HPO4(圖1-C)作流動相分析效果最好，各酸的分離度和峰形均滿足分離需求，9種有機酸在10 min內出峰完畢，且以此條件對樣品1進行分析，雜質和有機酸也能分離開來，能滿足檢測需求(圖1-D)。緩沖鹽的種類直接影響流動相的離子強度，而流動相的離子強度對可解離化合物的色譜峰峰形有顯著影響，因此3種不同離子強度的緩沖鹽對各有機酸的分離呈現不同的效果[14]。由圖1可見三者的背景吸收有著明顯差異，(NH4)2HPO4的背景吸收是最小的，干擾最小也最靈敏的。綜合考慮，選擇(NH4)2HPO4為流動相緩沖鹽。

2.3 流動相pH值選擇

以0.01 mol/L的(NH4)2HPO4作為流動相，用H3PO4調節流動相pH值分別為2.0、3.0和4.0，考察流動相pH值對混合標液中有機酸分離的影響。結果表明，pH對分離效果的影響很大：pH為2.0時琥珀酸和富馬酸分離不佳(圖2-A)，pH為4.0時草酸和酒石酸分離不佳且琥珀酸峰丟失(圖2-B)，只有當pH=3.0時9種有機酸分離效果最佳(見圖1-C)。流動相的pH影響樣品的離子化狀態，通常流動相的PH值必須高于或低于樣品的pKa1.5個單位，而本文所測的有機酸的pKa范圍較廣(1.2～6.2)，按此原理選擇pH值則超出了C18色譜柱的使用范圍(pH 2～8)。此外，色譜柱本身的性質也對流動相pH選擇有影響。色譜柱主要都是硅膠基質，現有的填料處理工藝無法將硅膠上殘余的硅羥基全部去除，硅羥基會造成樣品峰拖尾，一般認為硅羥基的pKa在3.5到4.5之間，低pH值能幫助抑制硅羥基的活性，減小拖尾，從而改善峰形，提高分離度[13]。因而在pH值為3.0時，各有機酸獲得了最佳的分離效果。

圖2 pH值為2.0(A)和4.0(B)時標樣的色譜圖Fig.2 The chromatograms of standards at pH 2.0(A) and pH 4.0(B)

2.4 檢測波長選擇

本實驗使用二極管陣列檢測器(DAD)進行檢測，混合標準品進樣后對各有機酸的DAD圖譜進行分析：9種有機酸的吸收強度從191 nm到400 nm的紫外波段基本呈下降趨勢，在190到220區間下降幅度最大，因而選取195、200、205和210 nm四個波長對混合標液進行檢測。結果發現檢測波長越低各有機酸的吸收強度越高，但是基線噪音也隨之增大。因而綜合考慮選擇200 nm為檢測波長，各有機酸吸收強度較高且基線噪音可接受。

2.5 線性范圍和檢出限

將不同濃度的有機酸混標溶液從低濃度到高濃度依次進樣，確定各有機酸的保留時間，計算各自的峰面積(每個樣平行進樣3次)。按實驗結果繪制各有機酸的標準曲線，以有機酸濃度(X)對色譜峰面積(Y)進行線性回歸，計算回歸方程(見表1)，以S/N計算檢出限。九種有機酸的峰面積和質量濃度的相關系數都在0.994～0.999之間，在設定的濃度范圍內線性關系良好。

表1 有機酸標準曲線

2.6 精密度

以圖1-C所示的混標溶液連續進樣5次，根據所得峰面積分別計算精密度，9種有機酸的RSD范圍在1.0%～4.4% 之間，表明儀器精密度良好，結果見表2。

表2 精密度實驗(n=5)

2.7 方法回收率

選擇1號樣品為加標基質，九種有機酸的回收率實驗結果如下表，回收率在83.8%～108.4%，證明該方法的準確性較高，適用于蘋果醋中有機酸的檢測分析。

表3 回收率試驗

2.8 樣品有機酸含量

使用優選的色譜條件對20種蘋果醋飲料分別進行檢測，得到其有機酸的含量，檢測結果如表4。

表4 蘋果醋樣品有機酸含量 單位：mg/kg

由檢測結果可以看出：

(1)20種蘋果醋飲料中檢出了7種有機酸：草酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、富馬酸、馬來酸、乳酸。酒石酸和琥珀酸在實驗所選20種蘋果醋飲料中均未能檢出。郭燕等[5]在檢測蘋果果實中的有機酸時發現所選品種中只有喬納金蘋果有檢出酒石酸，且含量甚微，在蘋果醋發酵過程中酒石酸含量會逐漸下降[15]，因而可能未檢出；而符笳茵等[16]在對不同品種醋中有機酸比較時也未能在蘋果醋中檢測到酒石酸和琥珀酸。4種酸(草酸、蘋果酸、乙酸和富馬酸)在20種蘋果醋飲料中均被檢測出，檸檬酸也在19種蘋果醋飲料中被檢出，其次是乳酸被檢出13次，馬來酸被檢出5次。實驗所選的蘋果醋飲料均含有5種以上有機酸，最多可達到7種有機酸。

(2)實驗所選20種蘋果醋飲料各自的有機酸總量可達到3.0～8.0 g/kg，平均含量5.6 g/kg。其中以檸檬酸、蘋果酸、乙酸平均含量較高，平均含量可達到2.66、1.7、1.1 g/kg。蘋果中本身就含有極高的蘋果酸，約占總酸總量90%左右[17]，而檸檬酸和乙酸則應是蘋果酒精發酵的綜合產物。

(3)對照國家推薦標準GB/T30884《蘋果醋飲料》，實驗所選20種蘋果醋飲料均符合“總酸含量≥3 g/kg”的要求，乳酸也基本符合標準中的“乳酸含量<250 mg/kg”要求。與趙芳[10]、陳義倫[12]等的研究結果一致[10,12]，大部分樣品的蘋果酸和檸檬酸含量都超出了標準的最大值范圍，蘋果酸和檸檬酸的平均含量高達1.7 g/kg及2.8 g/kg，而標準的要求為“蘋果酸含量50～1 000 mg/kg”“檸檬酸含量≤300 mg/kg”，樣品含量超出標準如此之多，可能在生產過程中存在人工添加的行為。20個樣品中只有2個樣品(16號和17號)符合蘋果酸含量小于1 000 mg/kg、檸檬酸含量小于300 mg/kg的要求，這2個樣品標簽標注為蘋果原汁發酵產品。

3 結論

本實驗對蘋果醋飲料中有機酸的檢測條件進行了篩選，確定了以0.01 mol/L (NH4)2HPO4為流動相(pH 3.0)，Waters sunfire C18為色譜柱，9種有機酸(草酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、馬來酸、乳酸和琥珀酸)在200 nm處得到完全分離。進而對市面上常見的20種蘋果醋飲料進行了有機酸成分的分析。檢測結果顯示不同品牌蘋果醋飲料含有的有機酸種類差異不大，平均都含有5種及以上有機酸，最多可達7種。樣品各自的有機酸總量可達到3.0～8.0 g/kg，平均含量5.6 g/kg，其中以檸檬酸、蘋果酸、乙酸平均含量較高，分別可達到2.66、1.7、1.1 g/kg。而在所有20個樣品中只有2個樣品符合標準GB/T30884《蘋果醋飲料》中對總酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸含量的要求，絕大部分產品的蘋果酸和檸檬酸含量超出標準要求。

由此可見，市面上的蘋果醋飲料就有機酸組成上來說差異不大，均含有較豐富的有機酸種類，而含量上蘋果酸和檸檬酸普遍過高，有可能存在人工添加的行為。蘋果醋曾經被譽為繼碳酸飲料、飲用水、果汁和茶飲料之后的“第四代飲料”，而今發展卻良莠不齊，人均消費量遠遠達不到預期，由本實驗的檢測結果來看，可能需要更加規范的生產方式和更加嚴格的市場監管。

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Organic acid analysis in apple vinegar beverage

LI Xi1, CHEN Qian2, TANG Wei2, ZHONG Ling-li1,FU Cheng-ping1, YANG Xiao-feng1*

1(Analysis and Determination Center, Sichuan Acedemy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)2(China Green Food Development Center, Beijing 100081, China)

Nine organic acids in apple vinegar beverage detecting method was established and the method was applied in 20 kinds of apple vinegar beverage. The separation was performed by 200 nm a C18column with 0.01 mol/L diammonium phosphate solution as mobile phase (pH 3.0). Nine kinds of organic acids (oxalic acid, acetic acid, citric acid, malic acid, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid and succinic acid) were completely separated under this condition. Each sample contained at least 5 kinds of acids, the most is up to 7 kinds of organic acids in 20 kinds of apple vinegar beverage. Oxalic acid, malic acid, acetic acid and fumaric acid were detected in all samples. The total organic acids content of the selected apple vinegar beverage can reach 3.0-8.0 g/kg, with an average of 5.6 g/kg. Citric acid, malic acid and acetic acid are higher on average content among others, with an average content of 2.66, 1.7, 1.1 g/L respectively. Only two out of 20 samples met with national standard GB/T30884 apple vinegar beverage on the content of total acid, lactic acid, malic acid and citric acid. The malic acid content and citric acid content of the majority of product were beyond the standard requirements.

apple vinegar;organic acid; reversed phase high performance liquid chromatography

10.13995/j.cnki.11 1802/ts.201702038

碩士研究生(楊曉鳳副研究員為通訊作者，E-mail：1945004861@qq.com)。

2016-06-06，改回日期：2016-06-30