冷凍保存卵巢組織移植術對年輕宮頸癌患者卵巢內分泌功能的影響

陳美一 邵茵 馬利國

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率占女性惡性腫瘤的第2位，僅次于乳腺癌。在我國，每年約有13萬新發病例，約占世界宮頸癌新發病例總數的28%[1]，且宮頸癌發病逐漸趨于年輕化。目前針對年輕的宮頸癌患者，在標準的手術治療之后通常進行術后放療。這種治療策略，雖然能夠提高治愈率，但放療會嚴重損傷卵巢組織。卵巢是女性重要的生殖和內分泌器官，能夠產生性激素及生成卵子，在調節激素代謝和內分泌中發揮重要作用。年輕女性失去卵巢功能，不僅會因性激素分泌下降出現圍絕經期癥狀，且會影響全身脂肪、鈣和磷代謝，導致心血管系統、神經系統、泌尿系統及基礎代謝的異常[2]，嚴重影響患者的生活質量。因此，在進行放療前行手術將卵巢取出后進行冷凍保存，待放療結束后選擇適當時機進行卵巢組織自體移植術，對保存和恢復患者的卵巢功能有很大的臨床價值。本研究通過觀察冷凍卵巢組織自體移植于患者前臂后對卵巢內分泌功能的影響，探討冷凍保存卵巢組織移植術恢復卵巢內分泌功能的可行性，為人類卵巢組織冷凍移植研究提供依據。

對象與方法

1.對象：8例卵巢組織標本取自年輕宮頸癌患者手術切除的正常卵巢組織。患者年齡28～42歲，均未絕經。臨床分期：Ⅰ b1期2例，Ⅰ b2期4例，Ⅱ a2期2例。病理診斷：1例Ⅱ a2期為宮頸腺癌，其他7例均為宮頸非角化型鱗狀細胞癌。手術方式：患者均行經腹或腹腔鏡下廣泛全子宮切除術+單側卵巢懸吊術+單側卵巢組織凍存。術后病理結果報8例患者病變均累及宮頸深肌層，其中1例累及宮頸全層，2例發生淋巴結轉移，全部病例術后僅接受放射治療。8例患者隨機分為兩組，對照組(3例)和凍存卵巢組織移植組(5例)。實驗獲得深圳市人民醫院倫理委員會同意，所有患者均簽署知情同意書。

2.主要試劑及儀器設備：二甲基亞砜(DMSO)、人白蛋白(HSA)、蔗糖購自Sigma公司，TCM-199培養基購自Hyclone公司。CL-8800冷凍儀，澳大利亞Cryologic公司。Beckman Coulter UniCel DxI 800化學發光免疫分析系統。

3.慢速冷凍方法冷凍和解凍卵巢組織：將卵巢組織迅速置于預冷的TCM-199培養基中，置于冰壺內，在離體30分鐘內轉移至實驗室。在無菌超凈工作臺內，用含青、鏈霉素的TCM-199培養基反復清洗2、3次，除去壞死組織及血跡。在×10體視顯微鏡下，用眼科鑷、眼科剪去卵巢髓質，僅留下卵巢皮質，切割為1.0 cm×1.0 cm×1.0 mm大小的組織塊。將卵巢組織塊放入盛有1 ml冷凍液(含1.5 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖+5% HSA的TCM-199培養基)的凍存管中，4 ℃平衡30 min后放入程序冷凍儀中，從4 ℃開始以2 ℃/min的速度降至-7 ℃，滲透10 min后植冰，持續10 min，然后以0.3 ℃/min速度降至-40 ℃，再以10 ℃/min速度降至-140 ℃，保持10 min，投入液氮并放入液氮罐保存。每例患者保存卵巢組織片10片。

解凍時取出凍存管，空氣中停留30 s后置于37 ℃水浴2～3 min，將卵巢組織置于含1.0 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖+1% HSA的TCM-199培養基中5 min，然后按濃度梯度依次洗脫冷凍保護劑：0.5 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖、0.25 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L蔗糖各停留5 min。

4.凍存卵巢組織自體移植手術：移植組在完成放療半年，除外病變復發后，將5～6片卵巢皮質組織扇形展開平鋪包埋于血管較豐富的前臂肱橈肌筋膜下，縫合筋膜及皮膚。

5.性激素測定：采用Beckman Coulter UniCel DxI 800化學發光免疫分析系統進行性激素的測定。對照組為完成放射治療后半年為時間起點，在此后的1個月、3個月、6個月、9個月及12個月進行檢測；卵巢凍存移植組在完成放射治療后半年進行卵巢凍存組織移植，移植術后1個月、3個月、6個月、9個月及12個月分別進行性激素及卵巢移植部位彩超檢查。

結果

1.卵巢內分泌激素水平：對照組3例在術后的放療及隨訪過程中均出現不同程度的圍絕經期癥狀和卵巢內分泌功能異常。在術后3個月時E2分泌水平顯著降低，FSH和LH也呈現高值水平，隨訪1年期間激素水平無改善。其中1例患者術后9個月出現E2明顯下降<20 pg/ml，FSH顯著升高>40 U/L，LH顯著升高>50 U/L，提示其卵巢功能衰竭(表1)。凍存卵巢組織移植5例在放療結束后行前臂凍存卵巢組織自體移植術，在移植后6個月后出現了卵巢內分泌功能的逐漸恢復。其中3例術后9個月E2分泌水平恢復正常，FSH和LH分泌量顯著降低，但1例術后1年失隨訪(表2)。

表1 對照組患者術前、術后性激素水平情況

表2 凍存卵巢組織自體移植術患者術前、術后性激素水平情況

2.移植部位卵巢超聲結果：凍存卵巢組織移植5例患者術后1個月移植部位卵巢大小、形態正常，內部有少量及點狀血流信號。術后6個月，移植部位卵巢內部可見血流信號和小卵泡發育，但是卵巢組織體積較前均出現縮小，其中2例縮小明顯(表3)。

表3 凍存卵巢組織移植術后移植部位超聲檢查結果

討論

隨著宮頸癌篩查體系的逐步完善及診治水平的不斷提高，宮頸癌患者5年生存率已顯著提高。臨床上，針對年輕的宮頸癌患者，通常在標準的手術治療之后行輔助性放療和(或)化療。放化療在極大程度緩解癌癥病情的基礎上，卻對卵巢組織造成了嚴重的不可逆轉的損傷，導致卵巢早衰，使得年輕女性患者在獲得長期存活的同時，也失去了卵巢內分泌功能及生育能力。近年來，隨著冷凍保存技術、血管吻合技術和輔助生殖技術的發展，凍存卵巢組織移植技術已成為解決年輕宮頸癌患者卵巢早衰、保存和恢復生殖內分泌功能的有效選擇[3]。目前凍存卵巢組織的移植主要包括異位移植和原位移植兩種。異位移植是將卵巢的皮質片移植到皮下，例如前臂和腹壁。原位移植通常是將卵巢的皮質片移植到保留的卵巢、卵巢韌帶或是卵巢窩附近[4-5]。Okaty等[6]為1例35歲III B期宮頸癌患者行前臂皮下凍存卵巢移植，術后18個月每個月都有優勢卵泡發育，并經皮吸收能夠獲得成熟的卵母細胞。Radwan等[7]報道一位28歲宮頸浸潤性腺癌患者行廣泛子宮切除術，并將每個卵巢切取一半進行冷凍保存。在術后行輔助性放療，患者出現典型的圍絕經期癥狀，E2分泌量為2 pg/ml，FSH分泌量為96.25 U/ml，LH分泌量為37.55 U/ml。隨后將凍融的卵巢組織自體移植到前腹壁，9周后卵巢內分泌功能開始逐漸恢復，24周后卵巢內分泌功能恢復到正常水平。多個團隊也報道了凍存卵巢組織自體移植后可恢復和維持卵巢功能，能夠獲得成熟卵母細胞，并成功生產新生兒[8-11]。

目前卵巢組織冷凍技術可根據凍存速度的不同分為快速凍存和慢速凍存兩種。慢速凍存，即程序化法(conventional freezing)，需要通過程序冷凍儀實現逐步地、程序化地降溫直至進入液氮。快速凍存，即玻璃化法(vitrification)，是一種把卵巢組織直接投入液氮的方法，它利用高濃度的冷凍保護劑所產生的玻璃態或無定形態在冷凍過程中可避免冰晶形成。這兩種方法均可用于卵巢組織的冷凍保存，慢速凍存作為一種常規方法被普遍采用，保存效果穩定。玻璃化凍存是一個新的、不成熟的技術,也是當前的一個研究熱點，但其對冷凍保護劑的要求高，目前沒有統一的操作規程，而且存在解凍后的卵巢組織被液氮中微生物污染的潛在危險，安全性不如慢速法。在冷凍保護劑選擇方面，二甲基亞砜和丙二醇被認為是冷凍卵巢組織效果最好的[12]。

本研究中8例宮頸癌患者行廣泛全子宮切除術后均需行輔助性放療，在手術同時行單側卵巢懸吊術和單側卵巢組織凍存。其中3例患者未進行卵巢組織移植，在術后3個月E2分泌水平顯著降低，FSH和LH也呈現高值水平。其中1例患者術后9個月出現E2明顯下降<20 pg/ml，FSH顯著升高>40 U/ml，LH顯著升高>50 U/L，提示其卵巢功能衰竭；另外2例患者在隨訪1年內卵巢內分泌功能逐漸降低，提示其卵巢功能受損。卵巢對放射性即為敏感，育齡期婦女盆腔放射劑量為單次4Gy或10天內照射總劑量15Gy，絕經前婦女5～10Gy便可導致卵巢功能受損甚至衰竭[13]。Toman等[14]測量了不同位點的卵巢接受盆腔外照射時射線劑量及對其功能的損傷程度的關系，指出只有放射野邊緣2.5 cm以外的區域是相對安全區域，建議至少將卵巢移植于髂前上棘之上3.5 cm。但也有報道指出由于放射線的散射作用，約有總劑量的5%可散射到放射野外4 cm范圍內[15]。本研究中3例行單側卵巢懸吊術的患者將卵巢移植于髂前上棘之上3～3.5 cm皮下，在術后隨訪過程中均出現了不同程度的性激素釋放異常和圍絕經期癥狀，提示單純的卵巢懸吊術式雖然能夠保留卵巢功能，但仍不能完全避免放療對卵巢組織的損傷，仍有一定的概率出現卵巢早衰。

本研究中另外5例患者在放療結束后選擇適當時機行凍存卵巢組織前臂自體移植術。在移植后6個月出現了卵巢內分泌功能的恢復，其中2例患者術后1年與未行卵巢移植的對照組性激素釋放水平相當，并未恢復正常水平。另外3例患者術后9個月E2分泌水平恢復正常，FSH和LH分泌量顯著降低；更有1例28歲的年輕患者在術后9個月性激素的釋放恢復到與廣泛全子宮清除術前相當的水平，已連續出現2次雌激素的明顯升高，但1年后失隨訪。5例患者移植術后1個月移植部位卵巢大小、形態正常，內部有少量及點狀血流信號。術后6個月，移植部位卵巢內部可見血流信號和小卵泡發育，但是卵巢組織體積較前均出現縮小，其中2例患者縮小明顯。卵巢組織凍存移植后功能的恢復已經得到國內外研究的廣泛證實，但是長期維持是目前此項技術研究的難點和焦點。目前關于移植后卵巢功能維持時間的長短報道不一，且多為個例報道。Baird等[16-17]對羊凍存卵巢組織移植后卵泡存活和發育情況進行長期觀察發現，卵巢內分泌功能維持了近1年。Oktay等[18]將卵巢組織移植到前臂皮下，2例患者卵巢功能分別維持了21個月和超過2年。本研究雖然樣本量較小，但是仍為需術后放療的年輕宮頸癌患者卵巢移植術式的選擇提供了依據。在提高生存率的同時，行單側卵巢懸吊術合并單側卵巢冷凍保存，待輔助性放療結束后選擇適當時機行凍存卵巢組織自體移植術，能夠最大限度地保留卵巢正常功能，提高患者術后生活質量。

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