松果菊苷對帕金森病模型大鼠海馬區神經元GSK-3β蛋白的影響

付貝貝，周紫婷，覃威，陳詩雅，鄭云夢，邱少斌，蔡晶（福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建福州350122）

松果菊苷對帕金森病模型大鼠海馬區神經元GSK-3β蛋白的影響

付貝貝，周紫婷，覃威，陳詩雅，鄭云夢，邱少斌，蔡晶
（福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建福州350122）

目的研究松果菊苷對PD模型大鼠海馬區神經元GSK-3β蛋白表達的影響。方法取雄性SD大鼠48只，隨機分為正常組、假手術組、PD模型組、松果菊苷治療組，用6-OHDA立體定向微量注射于大鼠右側內側前腦束制備帕金森?。≒D）大鼠模型，用Western Blot檢測4組大鼠海馬區神經元GSK-3β蛋白的表達。結果在相同條件下，PD模型組的大鼠海馬區GSK-3β蛋白的表達量高于正常組，用松果菊苷治療后，GSK-3β蛋白的表達量降低（P＜0.01）。結論松果菊苷可影響大鼠海馬區患側Wnt／β-catenin通路GSK-3β蛋白的表達，對帕金森病有一定的治療作用。

帕金森??；松果菊苷；GSK-3β蛋白；Wnt通路

松果菊苷是從肉蓯蓉中提取的有效成分，具有明顯的抗氧化、抗神經元凋亡、抗衰老、改善學習記憶能力等作用［1-4］。我們通過6-OHDA立體定向微量注射于大鼠右側內側前腦束制備帕金森病（Parkinson's disease，PD）大鼠模型，觀察探討松果菊苷通過大鼠海馬區神經元Wnt／β-catenin通路中GSK-3β蛋白表達的影響，研究松果菊苷治療對帕金森病的的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物取雄性SD大鼠48只，福建中醫藥大學實驗動物中心提供，體質量（200～220）g。飼養條件：福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物飼養室，光照12 h，黑暗12 h，室溫（20±2）℃，自由飲食與飲水，大鼠全價顆粒飼料喂養。

1.2 藥物與試劑肉蓯蓉購自福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，從中提取松果菊苷；6-羥基多巴胺（6-OHDA）、阿撲嗎啡（APO）、GSK-3β蛋白（美國Cell Signaling Technolegy公司）；抗壞血酸（美國Sigma公司）。

1.3 儀器外科手術器械、微量注射器、帕金森動物旋轉檢測儀（美國Columbus instruments公司）；SR－6N型顱腦定位儀（日本Narishige公司）、Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統、電泳儀、電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.4 PD模型分組及假手術組的制備48只SD大鼠按每籠4只飼養于通氣籠具，飼養2周后，取正常組12只，其它36只進行模型制備，造模前12 h禁食不禁水，稱體質量后隨機取36只大鼠腹腔注射10%水合氯醛（30 mg／kg）。麻醉后，頭頂部去毛，碘酒、乙醇消毒，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，沿顱頂正中線切開皮膚，鈍性分離顱骨外膜，暴露大鼠顱骨的前囟門。參照大鼠腦定位立體圖譜，以前囟為坐標原點，確定前腦內側束的三坐標：前囟后4.8 mm，矢狀縫右側1.2 mm，硬腦下7.8 mm，用顱骨鉆鉆孔，用微量注射器將6-OHDA立體定向注射，注射量8 μg，濃度2 μg／μL，溶解于含0.1%抗壞血酸的生理鹽水中。注射速度1 μL／min，注射后留針10 min，緩慢出針，局部消毒縫合頭皮。用骨蠟封閉大鼠腦部的顱骨孔，常規消毒，縫合皮膚。假手術組11只，手術過程同上，注射等量生理鹽水，正常組不做處理。術后7 d，每日腹腔注射青霉素100萬U／kg預防感染。

1.5 PD模型組篩選及松果菊苷治療組干預造模3周后，皮下注射阿撲嗎啡0.5 mg／kg，溶解于含0.1%抗壞血酸的生理鹽水中，于旋轉檢測儀中誘導大鼠檢測其旋轉，記錄30 min內大鼠的旋轉次數，每min恒定轉向左側且旋轉次數大于或等于7圈的模型為成功的模型20只，將成功的模型隨機平均分成PD模型組10只，松果菊苷治療組10只。

挑選出造模成功大鼠進行藥物干預，治療組每日灌胃松果菊苷溶液，濃度5 mg／mL，灌胃量40 mg／kg。給藥時間上午10時，連續10 d，每周稱體質量1次，調整給藥量，其余3組灌等體積的生理鹽水。

1.6 取材處理大鼠取仰臥位在解剖臺上，固定四肢，接著用20%烏拉坦（5 mL／kg）腹腔注射麻醉，剪開腹部皮膚，暴露腹腔。沿著腹中線和胸骨中線向上剪開胸骨，沿著膈肌向兩側皮膚剪開，并用止血鉗將胸骨和胸部皮膚鉗緊，將止血鉗翻向外側以充分暴露心臟，將剪除針尖的灌注針由左心室推入升主動脈固定，夾閉胸主動脈，灌注等滲鹽水（37℃），灌流量20 mL／min。剪開右心耳，當流出液體清亮時，用4%多聚甲醛（4℃）進行固定，先快速灌注50 mL，再緩慢灌注50 mL，固定液進入大鼠血管后，頸部僵硬后完成固定。隨即迅速斷頭取腦，在枕骨大孔處斜插入剪刀剪開頂骨，用止血鉗掰斷兩端頂骨，注意嗅球上的頂骨也要仔細的去掉，用剪刀于一側剪斷視神經并探測到顱底，就可以將整塊的腦組織翹起，小心地從枕骨大孔將腦組織置于4%多聚甲醛中，放4℃冰箱固定4 h。

1.7 Western blot檢測GSK-3β蛋白表達勻漿上清用Brad-ford法進行蛋白定量，用SDS-PAGE對蛋白樣品進行分離，分離的蛋白用半干電轉移法轉移到固相載體上，固相載體以非公價健的形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物活性不變。印跡先用5%的BSA或脫脂奶粉溶液處理以封閉NC膜上剩余的疏水結合位點，室溫下封閉液作用1 h，再加入用封閉液稀釋的1∶1000一抗（兔抗鼠GSK-3β蛋白和磷酸化GSK-3β蛋白單克隆抗體）4℃過夜；洗液洗滌3 min×3次，辣根過氧化物酶標記稀釋的1∶1000二抗孵育2 h，用增強型化學發光顯色系統顯示蛋白條帶，感光在膠片上。實驗重復3次。

1.8 觀測指標用Western blot蛋白印記法，以β-actin作為參照，分析GSK-3β蛋白表達量的變化。

2 結果

2.1 造模結果雄性SD大鼠48只，造模過程中死亡3只，PD模型組、松果菊苷治療組誘導后旋轉的老鼠20只，進入研究43只，其中正常組12只，假手術組11只，PD模型組10只，松果菊苷治療組10只。

2.2 WesternBlot結果見表1、圖1。

表1 4組大鼠海馬區GSK-3β蛋白表達的灰度值比較

表1 4組大鼠海馬區GSK-3β蛋白表達的灰度值比較

注：與正常組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01；治療組組內左右側比較，5）P＜0.05。

組別模型組假手術組正常組治療組海馬左側右側左側右側左側右側左側右側GSK-3β 16468175.33±2282272.9252）15242614.67±2112192.8732）10400872.00±1390922.347 12844433.33±1762210.252 10994847.00±1535084.625 10166038.00±1353377.093 11620531.00±1628166.9391）3）12023535.33±1701206.3801）3）5）β-actin 5485267.33±51177.520 5507117.00±39022.320 5522873.33±53960.124 5496912.33±70483.927 5493591.67±75988.139 5515395.00±38210.527 5519321.67±22695.639 5516301.33±37196.415 GSK-3β／β-actin 3.0050±0.44502）2.7692±0.39912）1.8847±0.2686 2.3395±0.3508 2.0041±0.3076 1.8442±0.2572 2.1062±0.30361）3）2.1809±0.32251）3）5）

圖14 組大鼠海馬區GSK-3β蛋白電泳圖

3 討論

3.1 本實驗中通過6-OHDA為選擇性DA神經元化學損毀劑，當注射至大鼠紋狀體后可被DA神經元末梢通過軸突逆轉運至黑質內的細胞體內；或注射至大鼠黑質內時，6-OHDA與DA競爭攝取位點，能被攝取到細胞中。胞體的膜轉運體轉運6-OHDA到細胞內，經氧化生成神經毒物質，如羥自由基和醌類，使DA神經元的抗氧化系統破壞，線粒體功能損傷，膜穩定性和DNA完整性破壞，使細胞變性、死亡。Gong等［5］研究發現，6-OHDA通過抑制Akt活性激活GSK-3β，進而誘導神經細胞凋亡，GSK-3β也參與調節了神經元凋亡過程。因此，GSK-3β抑制劑可阻斷帕金森病患者神經元損傷。3.2實驗表明，PD模型組中由于顱內注射6-OHDA，在GSK-3β蛋白，表達水平高于正常組。說明Wnt／β-catenin通路中，6-OHDA通過抑制Akt活性激活GSK-3β蛋白使其表達水平發生上調。Santra等［6－9］研究結果也有相似表現。在松果菊苷治療組中，GSK-3β蛋白表達低于PD模型組，說明ECH的干預治療對GSK-3β蛋白表達起到一定的抑制作用。6-OHDA導致大鼠海馬區神經元的損傷，導致沒有Wnt配體去激活該通路，因此PD模型組GSK-3β蛋白的表達水平增加。在用松果菊苷干預治療以后，松果菊苷治療組GSK-3β蛋白的表達低于模型組。

綜上所述，松果菊苷可通過發揮類GSK-3β蛋白抑制劑的作用，調控帕金森病大鼠模型海馬區Wnt／β-catenin通路的GSK-3β蛋白的表達量來改善帕金森病的癥狀。

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R285.5

A

1000-338X（2017）01-0037-03

2016-12-07

國家衛生和計劃生育委員會科研基金資助課題（WKJ－FJ-38）

付貝貝（1994—），女，2013級臨床醫學專業，主要從事中西醫結合老年神經系統疾病研究。

蔡晶（1960—），女，教授。E-mail：caiji@163.com