碎秈米蛋白質中性蛋白酶酶法提取工藝優化

李玉珍，肖懷秋

（湖南化工職業技術學院制藥與生物工程學院，湖南株洲 412000）

碎秈米蛋白質中性蛋白酶酶法提取工藝優化

李玉珍，肖懷秋

（湖南化工職業技術學院制藥與生物工程學院，湖南株洲 412000）

為提高碎秈米蛋白質提取率，在析因設計和爬陡坡實驗基礎上，利用中心組合響應面優化技術對碎秈米蛋白質中性蛋白酶酶法提取工藝進行了優化分析，建立了碎秈米蛋白質酶法提取工藝二階多項式非線性回歸方程和數值模型，驗證了模型精準度并分析了加酶量（X1）、酶解時間（X2）和固液比（X3）對蛋白質提取率的影響規律，以蛋白質提取率和蛋白質純度為評價指標。優化方案為加酶量0．98%，固液比1∶10．20，酶解時間74．4 min，pH7．0和50℃。在優化條件下蛋白質提取率為89．82%±1．06%（n＝3），與模型預測值91．23%基本吻合，偏差為－1．55%，所提取大米蛋白質純度為81．02%。

碎秈米蛋白質；中性蛋白酶；酶法提取；響應面優化

由于當前碾米技術水平的限制，大米加工中會產生10%～15%的碎米，我國每年碎米產量達到2 000～3 000萬t，特別是秈米，由于其細胞結構的特殊性，碎米率更高［1］。碎秈米營養價值高，氨基酸配比合理，特別是賴氨酸是谷物中最高的，而且大米蛋白質是谷物中唯一的低過敏性蛋白質［2］。隨著人們對大米蛋白營養價值和低過敏性的認同，大米蛋白質研究成為一個新的熱點。大米中蛋白質主要為堿溶性的米谷蛋白，在胚乳中與淀粉結合緊密，較難溶出，堿液處理能降低蛋白質與淀粉結合作用力，使極性基團發生解離，并使大米蛋白質分子表面帶負電荷，起到增溶作用，有利于淀粉與蛋白質的分離［3］，堿法提取成為當前大米蛋白質提取的主要方法。孫慶杰［4］、萬娟［5］、王威［6］等人研究了大米蛋白質堿法提取工藝并進行優化分析。堿法提取工藝簡單，操作方便，可疏松大米淀粉—蛋白質緊致結構，但堿液易造成大米蛋白質理化性質的改變，破壞氨基酸的結構，營養價值銳減并產生潛在有毒物質。而且堿法提取液中淀粉含量高，等電沉淀需消耗大量酸，透析脫鹽難度大，因此，大米蛋白質提取逐步向酶法提取轉變。葛娜［7］、趙叢叢［8］、王章存［9］等研究了堿性蛋白酶酶法提取大米蛋白工藝條件。堿法提取雖反應條件溫和，液固比小，但存在酶解產物發生Maillard反應嚴重，需消耗大量堿液以維持其堿性環境以及產物有咸味等缺陷，實際應用中受到一定限制［10］。鑒于堿法提取和堿性蛋白酶法提取過程存在的諸多問題，本實驗利用中性蛋白酶進行碎秈米蛋白質的酶法提取，在析因設計和爬陡坡實驗基礎上應用中心組合響應面優化技術對碎秈米蛋白質酶法提取工藝進行優化，構建影響因素數值模擬，以期為碎秈米蛋白質高效增值加工提供技術和理論支持。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 材料

碎秈米：市售；中性蛋白酶（5．2×104U／g）：北京中生瑞泰科技有限公司；其它試劑均為國產分析純。

1．1．2 主要儀器與設備

LABCONCO冷凍干燥儀：美國Labconco公司；HERMLE Z323K冷凍離心機：德國Hermle公司；722型可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；KQ－300DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1．2 方法

1．2．1 碎秈米常規組分分析

蛋白質測定采取凱氏定氮法、脂肪測定采取索氏抽提法、水分測定采取直接干燥法、灰分測定采取灼燒法進行含量測定［11］。

1．2．2 碎秈米蛋白質酶法提取工藝

準確稱取一定量經烘干并粉碎（80目）的碎秈米于酶解反應體系中，依據固液比要求加入去離子水攪拌均勻，超聲波預處理10 min，調節pH值，根據加酶量要求精準稱取中性蛋白酶添加到反應器中并緩慢攪拌，酶解過程注意維持pH恒定，酶解完成后滅酶，用4 000 r／min離心20 min，收集上清液并冷凍干燥，即得到碎秈米蛋白質。

1．2．3 碎秈米蛋白質提取工藝的優化

1．2．3．1 Min－Run Res IV析因設計

在預備實驗基礎上，考察加酶量、酶解時間、固液比、酶解pH和酶解溫度5個因素對碎秈米蛋白質提取的影響。實驗因素與水平如表1所示。

表1 析因設計因素與水平

1．2．3．2 爬陡坡實驗

響應面優化所擬合回歸方程只有在最優鄰域才能充分近似真實條件，若偏離最優鄰域，擬合方程將與真實條件不符或失去實際意義［12］。為使各因素同時逼近最優鄰域，基于析因設計方差分析和主效分析結果以及模型系數符號設定主效因素爬坡方向及步長。

1．2．3．3 響應面優化

應用二次旋轉中心組合響應面優化技術對酶法提取工藝進行優化分析。各因素均設置5水平，即±r（上下星號臂），±1（上下水平點）和0（零水平，n＝3），本實驗星號臂r＝1．682。實驗因素與編碼水平如表2。在優化條件下重復3次提取實驗并對比模型預測值與實測值的偏差以驗證模型精準度。

表2 因素編碼與實際水平

1．2．4 蛋白質含量與提取率測定

碎秈米固體蛋白質和溶液蛋白質分別采用凱氏定氮法測定（轉換系數為5．95［13］）和考馬氏亮蘭法測定。蛋白質提取率與純度按下式計算。

2 結果與分析

2．1 碎秈米常規組分分析

對碎秈米常規組分含量進行了分析，水分含量為10．6%，蛋白質含量為8．17%，脂肪含量為1．34%，灰分含量為0．87%。

2．2 Min－Run Res IV析因設計

加酶量、固液比、酶解時間、酶解pH和酶解溫度對碎秈米蛋白質提取的影響見表3。

利用Design expert 8．0．6對表3數據進行回歸分析，得到線性回歸方程為y＝59．96＋12．40X1＋3．30X2＋5．80X3－1．15X4＋3．29X5。

表3 Min－Run Res IV析因設計因素水平與結果

對表3數據進行方差分析和主效分析，得到各因素影響顯著性和百分貢獻率如表4。

表4 析因設計方差與主效分析結果

從表4可看出，模型顯著性分析為極顯著（P＜0．01），信躁比為（SNR）為18．549（＞4），說明模型精度符合要求。由于模型存在交互作用，不能用回歸系數絕對值表示因素作用的大小，宜采用因子百分貢獻率來比較［12］。其中，X1、X2、X3、X5百分貢獻率分別為69．86%、4．63%、14．34%和4．61%，累積之和為93．44%，為主效因子。

2．3 爬陡坡實驗

各主效因素爬坡方向及步長見表5。

由表5可看出，最優鄰域在3號，提取率最高（81．67%），此條件作為中心組合響應面設計中心點。

表5 爬陡坡實驗設計與結果

2．4 響應面優化分析

對加酶量、固液比和酶解時間進行中心復合響應面優化分析，實驗方案與結果見表6。為減少實 驗誤差，實驗隨機安排。

表6 響應面優化設計與實驗結果（含模型預測值）

2．4．1 響應面模型序貫分析與數學建模

響應面模型序貫分析結果如表7所示。

表7 響應面模型構建序貫分析

由表7可以看出，一階線性模型顯著性分析為不顯著（P＞0．05），失擬項極顯著（P＜0．01）。失擬項顯著表示用該模型進行結果預測可能存在較大誤差，需用更高階模型進行數值擬合［14］；二因素交互關系模型失擬項也極顯著（P＜0．01），也不宜對數據進行擬合。二階模型顯著性分析為極顯著（P

＜0．001），且失擬項不顯著（P＞0．05），可用于數值模擬。三階模型顯著性分析不顯著（P＞0．05），失擬項顯著（P＜0．05），不宜用于數值分析。因此，選擇二階模型進行數值擬合分析是最合適的。對表6數據進行多項式非線性回歸擬合可得到回歸方程為：y＝88．80＋5．25X1＋4．13X2＋4．90X3－1．12X1X2＋0．88X1X3－1．41X2X3－6．45X12－12．28X22－6．82X32。

2．4．2 回歸模型方差分析

模型方差分析結果如表8所示。

表8 回歸模型方差分析

從表8可看出，模型影響極顯著（P＜0．01）。確定系數為0．99 06，說明能解釋總變異的99．06%。變異系數（coefficient of variance，CV）是衡量模型精密度和可靠性的重要參數，數值越小表示模型越可靠［15］。模型CV為2．88%；模型信噪比（SNR）為27．642（＞4），信躁比大于4表明所構建模型是可靠的［13］；失擬項不顯著（P＞0．05）表示應用該數值模型進行數值估測不會造成失真，本模型失擬項不顯著（P＞0．05）。模型一次項、二次項影響均極顯著（P＜0．01），而交互作用項影響均不顯著（P＞0．05）。直接比較回歸方程一次項系數絕對值大小和基于模型方差分析可判定因子影響的主次順序［14］，即加酶量（X1）＞酶解時間（X3）＞固液比（X2），與析因設計結果一致。

2．4．3 降維分析（交互作用分析）

當其它因素為零水平時觀察某兩個因素對響應值的影響可繪制出交互因素項的響應曲面圖和等高線圖。響應曲面坡度平緩，表明因素變化對響應值影響不大，若響應曲面坡度非常陡則說明因素變化對響應值影響顯著［15］。由圖1可看出，因素交互作用項對響應值影響均不顯著。

圖1 y＝f（X1，X2），y＝f（X1，X3）和y＝f（X2，X3）響應曲面圖和等高線圖

2．4．4 模型最優解求解與驗證實驗

將回歸方程分別對各自變量求一階偏導并令結果為零，聯立方程組解逆矩陣可得到方程最優解：x1＝0．45，x2＝0．17和x3＝0．37，即加酶量0．98%，固液比1∶10．20（g∶mL），酶解時間74．4 min。為驗證模型精準度，在優化條件下進行重復實驗，結果為89．82%±1．06%（n＝3），與模型預測值91．23%基本吻合，偏差為－1．55%，提取大米蛋白質純度為81．02%。

3 結語

響應面優化技術通過局部優化來擬合因素與響應值的全局函數關系，并對因素及其交互作用進行優化和統計分析的實驗方法，二次旋轉中心組合設計具有實驗次數少、計算簡便、回歸系數間無相關性等優點，利用旋轉性還可克服預測值方差對實驗點在因子空間位置的依賴性［15－16］。本實驗在析因設計、爬陡坡實驗基礎上，利用二次旋轉中心組合響應面優化設計研究了碎秈米蛋白質提取的影響機制并進行了優化分析，驗證了模型精準度，分析了加酶量、酶解時間和固液比對蛋白質提取的影響，獲得了碎秈米蛋白質中性蛋白酶酶法提取優化條件，即加酶量0．98%，固液比1∶10．20（g∶mL），酶解74．4 min，pH 7．0和50℃。重復驗證實驗結果為89．82%±1．06%，與模型預測值基本接近，偏差為－1．55%。實驗結果優于王威［16］等以米渣為對象的中性蛋白酶酶法提取率。蛋白質提取率與孫慶節［4］堿法提取結果相近，蛋白質提取率和純度均優于萬娟［5］堿法提取工藝。與葛娜［7］、趙叢叢［8］等堿性蛋白酶酶法提取相比，蛋白質提取率和純度均優于文獻結果。結果表明，利用中性蛋白酶進行碎秈米蛋白質提取可以獲得滿意的結果，而析因設計、爬陡坡實驗與中心復合響應面優化設計聯用可以很好的用于碎秈米的蛋白質提取工藝的優化分析。

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［8］趙叢叢，曾里，宋娜，等．堿性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究［J］．食品與發酵科技，2010，46（1）：85－88

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Optimization of enzymatic extraction of protein from broken indica rice

LI Yu－zhen XIAO Huai－qiu
（College of Pharmaceutical and Biological Engineering，Hunan Chemical Vocational Technical College，Zhuzhou Hunan 412000）；Pharmaceutical and bioengineering school，Hunan Vocational Technical College of Chemical and Industrial Technology，Zhuzhou Hunan 412000）

To improve protein extraction efficiency from broken indica rice，the technology of extraction of broken indica rice protein extracted by neutral proteinase enzymatic extraction was optimized by central composite design and response surface analysis based on the results of Min－Run Res IV factorial design and steep accent experiment．The second－order polynomial nonlinear regression equation and mathematical model were established．The accuracy of the model was validated．The effects of enzyme loading amount X1，enzymolysis time X2，solid－liquid ratio X3on rice protein extraction rate were analyzed with protein extraction rate and protein purity as the appraisal indexes．The optimum conditions were，enzyme loading amount 0．98%，solid－liquid ratio 1∶10．20，enzymolysis time 74．4 min，pH 7．0 and 50℃．The confirmation experiments were carried out under the optimum conditions，the PER was 89．82% ± 1．06%（n＝3，which was well agreement with the predicted value（91．23%）．The deviation between the measured and predicted condition was－1．55%．The rice protein purity was 81．02%．

broken indica rice protein；neutral proteinase；enzymatic extraction；response surface methodology

TS 210．9

A

1007－7561（2017）02－0022－06

2016－10－8

湖南省教育廳科研項目（16C0550）；湖南省高校科研項目（12C1049）；湖南化工職業技術學院科研項目（HNHY2015 002）．

李玉珍，1981年出生，女，碩士，講師．

肖懷秋，1981年出生，男，碩士，副教授．