福州2009—2014年甲型H1N1流感病毒株HA基因進化分析

陳智偉　姚栩　謝乃鴻

【摘要】 目的：分析福州地區2009-2014年甲型H1N1流感病毒株的HA基因序列和遺傳特征。方法：采集流感樣病例的咽拭子標本，用MDCK細胞培養法和Real-time RT-PCR法對6株分別來自2009-2014年的病毒株進行病毒分離、鑒定，HA基因片段通過RT-PCR法進行擴增后克隆到pMD18-T載體上，并測定6株病毒株的HA基因序列。通過生物軟件BioEdit對該分離株和GenBank中相關毒株的序列進行基因進化樹分析。結果：6株分離株的HA基因推導氨基酸序列與參考株A/California/04/2009相比，2009-2014年HA1區氨基酸發生了突變，主要是位于136、145、188、189、192和193位點。結論：近幾年，福州地區H1N1流感的HA基因序列與世界流行的病毒參考株具有高度同源性，并多處氨基酸發生替換而產生抗原性漂移。

【關鍵詞】 甲型流感病毒； 血凝素； 序列分析； 進化樹

【Abstract】 Objective：To investigate HA genetic characteristic of influenza type A H1N1 virus in Fuzhou from 2009 to 2014.Method：Acquisition of influenza like cases of throat swab specimens by MDCK cell culture method and Real-time RT-PCR method in 6 strains from 2009 to 2014 were isolated and identified. The HA gene fragment was amplified and cloned into pMD18-T vector by RT-PCR method， and determination of HA gene sequences of 6 virus strains.The phylogenetic tree of the isolates and GenBank was analyzed by BioEdit.Result：The deduced amino acid sequence of HA gene of 6 strains compared to reference virus A/California/04/2009， HA protein of the isolate viruses from 2009 to 2014 had amino acid mutation in sites of 136，145，188，192 and 193.Conclusion：In recent years，the HA gene sequence of H1N1 influenza in Fuzhou region is highly homologous to the worlds most popular virus reference strains，and many amino acids are replaced to produce antigenic drift.

【Key words】 Influenza H1N1 virus； HA gene； Sequence analysis； Phylogenetic tree

First-authors address：Fuzhou Center for Disease Control and Prevention，Fuzhou 350004，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.07.002

2009年第一例甲型H1N1流感病毒在墨西哥被檢測出后在該地區流行，并在全世界各個國家和地區大流行。經過世界衛生組織（WHO）鑒定此型流感為“人感染豬流感”，后將其更名為“甲型H1N1流感”。2009年6月11日，界衛生組織將甲型H1N1流感流行級別提升至6級。豬流感病毒屬正黏病毒科，A型流感病毒的負鏈RNA病毒，是引起豬呼吸道疾病的重要病原體[1]。此次流行主要是因為豬的呼吸道上皮細胞同時感染禽流感病毒受體和人流感病毒受體，從而在豬上皮細胞內進行基因重排（抗原轉變，antigen shift），最近發現的H1N1流感病毒重組由于基因同源重組[2]。血凝素抗原（HA）蛋白是介導病毒和細胞表面結合的主要蛋白，也是流感的重要保護性抗原[3]。流感病毒感染同一細胞時常發生基因重排，從而產生新的病毒株。其中HA是流感病毒病毒的主要抗原，是由三個血凝素蛋白聚合在一起形成三聚體結構，頭部由HA1亞單位形成，是流感病毒與細胞受體結合的關鍵蛋白，該蛋白和機體免疫相關，此外HA1蛋白是流感發生抗原性漂移的分子基礎，此次新型甲型H1N1流感病毒大流行，主要也是因為H1N1流感病毒的基因重排和HA1蛋白的抗原性漂移[4]。為進一步了解福州市新型甲型流感H1N1病毒的流行和基因特性，本研究選擇6株病毒株，分別來至福州地區2009-2014年的病毒株，進行HA基因組序列測定，對其HA基因的特征和進化特點進行分析，為進一步開展福州地區流感防治工作以及為流感病毒分子生物學研究提供科學依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取6株分別來自2009年

1月-2014年1月新型甲型流感病毒株，來源于福州市疾病預防控制中心的H1N1流感病毒株并保存-80 ℃。

1.2 主要試劑和細胞 狗腎傳代細胞（MDCK）由福建省疾病預防控制中心提供，流感病毒的標準抗原和標準抗血清由國家流感中心提供。RNA提取試劑盒購于TAKARA，RT-PCR試劑盒采用TAKARA公司（OneStep RT-PCR Kit），擴增引物采用世界衛生組織官方網站提供的HA基因擴增引物，擴增產物用于測序。

1.3 引物設計與合成 核酸擴增及序列測定引物參照WHO提供的HA基因組測序引物[5]。

1.3.1 核酸提取與cDNA的制備 病毒核酸提取在生物二級實驗室進行，采用TAKARA公司的一步法試劑盒。

1.3.2 HA基因擴增與分析 用于瓊脂糖凝膠電泳法對PCR擴增產物進行分子量大小分析，并對PCR產物純化回收后進行測序分析。

2 結果

2.1 病毒分離與鑒定 采集的6株2009-2014流感樣標本，感染MDCK細胞3 d 左右后，CPE達到三個+時，收集細胞上清液進行實時熒光PCR進行H1N1亞型的確認。

2.2 HA序列測定與拼接 采用WHO提供的HA測序引物擴增的PCR產物進行測序，序列的拼接采用BioEdit生物軟件，并用MEGA 4.0進行進化樹分析。

2.3 HA基因進化樹分析 6株H1N1流感病毒的HA基因核苷酸序列系統進化樹分四個簇，見圖1。其中福州地區流行的H1N1病毒的核苷酸序列主要來源于禽流感和季節性流感H1并與豬流感病毒重組形成新的H1N1流感病毒株，本次篩選的6株甲型H1N1分離株核苷酸序列之間的同源在98%以上，進一步表明這6株病原體均來自同一簇，其中2009年度分離的病毒株與標準株A/California/07/2009（H1N1）親緣關系較近，而2010-2014年在同一個分支，距離相對較遠。

2.4 分離株HA1基因片段的氨基酸序列分析 HA蛋白由HA1（326個氨基酸）和HA2（223個氨基酸）兩部分組成，主要抗原決定簇是在HA1區，A/California/07/2009（H1N1）是一個國際代表株。HA1基因片段發生了16個點突變，其中在A區有2個氨基酸位點發生變化，分別為136（K>H）和145（R>K），抗原決定簇B區有4個氨基酸位點發生變化，分別為188（K>M）和189（T>A），192（H>D/N）和193（K>T），分離株有多處氨基酸發生替換，氨基酸的替換導致毒株的抗原性發生了漂移。另外，糖基化方面保留了古典豬H1N1的特點。見圖2。

3 討論

2009-2014年流感樣病例分析表明，福州地區的流感病毒主要流行的亞型為B型，而甲型H1N1和H3亞型分別占有一定比例，這個結果和福建省的監測結果一致。文獻[6]進一步分析福州地區流行的甲型H1N1流感毒株與在全國范圍內主要流行株的同源性，并進一步確認所在的哪一個簇。流感病毒的HA基因作為流感病毒主要表面抗原之一，其遺傳基因進化表現出強的活躍性，同時也是流感病毒發生抗原漂移和分子變異的基礎，其中HA1蛋白是病毒與細胞結合受體的關鍵[7-9]。相對于HA2蛋白，HA1蛋白承受著更大的免疫選擇壓力，因此HA1基因的變異直接影響流感病毒抗原的漂移[3-4，10]。隨著流感疫苗的接種人員擴大，并根據世界衛生組織的推薦疫苗進行接種，人群的免疫能力增強，然而流感病毒發生抗原漂移的可能性也隨之加大[11]。從統計學意義上，要確認發生抗原漂移，至少需要需要再HA1區上有4個以上氨基酸發生了突變，而且其中有3個是在抗原決定簇上[10，12-13]。6株分離株的HA氨基酸序列與參考株A/California/04/2009相比，2009-2014年HA1區分別有4、4、5、4個氨基酸發生了突變，主要是位于136、145、188、189、192和193位，福州地區H1N1流感的HA基因序列與世界流行的病毒參考株具有高度同源性，并發現多個的氨基酸發生點突變，確認為抗原性漂移[12，14]。

從HA基因進化樹分析結果顯示，

A/California/07/2009（H1N1）與福州2009年的分離毒株和疫苗株親緣關系較近，但是和2010-2014年的流感病毒株分別處于不同的分支，其親緣關系較遠。因此，從基因特性分析可以推測到，近6年根據WHO疫苗推薦株生產的疫苗對該年大連市H1N1亞型流感預防效果較理想[11，15]。

此次流行的甲型H1N1流感病毒，主要是由于流感病毒的抗原性發生變異，尤其是HA1區的抗原決定簇[2，16]，其次是由于中國對豬群流感病毒的檢測和流行并沒有較好的監測系統，從而導致在豬群中引起流感大暴發的病毒和人或禽的流感進行重組，而不能被及時發現和預測、預警[17]，不同亞型的病毒有可能在不同種屬的動物呼吸道上皮細胞上進行基因重組[18]。所以，應在世界衛生組織全球范圍內加強對甲型H1N1流感病毒監測，同時對可能是基因重組的流感病毒株進行病毒全基因組序測序，進而分析病毒基因突變的現狀并為流感疫苗的研制做準備[15，19-20]，使得流感疫苗能更好地防控流感流行，并為流行趨勢的改變制定防控方案提供病原學科學依據。

參考文獻

[1]舒躍龍.新A（H1N1）病毒疫情及病原學概述[C].全國新甲型H1N1防控培訓，2009：5.

[2]高靈茜，崔夢一，樊曉暉.豬流感病毒基因池中的新成員：新甲型H1N1流感病毒基因片段的存在及潛在威脅[J].中國人獸共患病學，2016，32（9）：832-837.

[3] Hillyard D R.Novel swine-origin influenza A （H1N1） virus investigation team[J].N Engl J Med，2009，360：2605-2615.

[4] Guan Y，Shortridge K，Krauss S，et al.Emergence of avian H1N1 influenza viruses in pigs in China[J].Journal of Virology，1996，70（11）：8041-8046.

[5]李燕婷，陳健，孔立群，等.1990～2004年上海市甲型流感病毒基因特性的研究[J].疾病監測，2006，21（4）：178-182.

[6]謝劍鋒，沈曉娜，王美愛，等.福建省甲型 H1N1 流感病毒分離及首例分離株全基因組序列分析[J].中國人獸共患病學報，2009，25（8）：745-748.

[7] de la Rosa-Zamboni D，Vázquez-Pérez J A，?vila-Ríos S，et al.Molecular characterization of the predominant influenza A （H1N1） pdm09 virus in Mexico， December 2011-February 2012[J].PLoS One，2012，7（11）：e50 116.

[8] Smith G J，Vijaykrishna D，Bahl J，et al.Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic[J].Nature，2009，459（7250）：1122-1125.

[9] Neumann G，Noda T，Kawaoka Y.Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus[J].Nature，2009，459（7249）：931-939.

[10] Caton A J，Brownlee G G，Yewdell J W，et al. The antigenic structure of the influenza virus A/PR/8/34 hemagglutinin （H1 subtype）[J].Cell，1982，31（2）：417-427.

[11] Shieh W J，Blau D M，Denison A M，et al.2009 pandemic influenza A （H1N1）：pathology and pathogenesis of 100 fatal cases in the United States[J].The American Journal of Pathology，2010，177（1）：166-175.

[12] Munster V J，de Wit E，van den Brand J M，et al.Pathogenesis and transmission of swine-origin 2009 A （H1N1） influenza virus in ferrets[J].Science，2009，325（5939）：481-483.

[13] Xu R，Ekiert D C，Krause J C，et al.Structural basis of preexisting immunity to the 2009 H1N1 pandemic influenza virus[J].Science，2010，328（5976）：357-360.

[14] Birnkrant D，Cox E.The emergency use authorization of peramivir for treatment of 2009 H1N1 influenza[J].New England Journal of Medicine，2009，361（23）：2204-2207.

[15]宋克云，張如勝，歐新華.長沙A（H1N1）亞型季節性流感暴發疫情的實驗室診斷及其 HA 基因特性分析[J].微生物學通報，2009，36（12）：1865-1870.

[16]李顯錄.甲型H1N1流感臨床觀察及治療體會[J].中國醫學創新，2010，7（29）：64-65.

[17] SteelFisher G K，Blendon R J，Bekheit M M，et al.The publics response to the 2009 H1N1 influenza pandemic[J].New England Journal of Medicine，2010，362（22）：e65.

[18]郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其實驗技術[M].北京：中國三峽出版社，1997.

[19] Ives J，Carr J，Mendel D，et al.The H274Y mutation in the influenza A/H1N1 neuraminidase active site following oseltamivir phosphate treatment leave virus severely compromised both in vitro and in vivo[J].Antiviral Research，2002，55（2）：307-317.

[20] Trifonov V，Khiabanian H，Greenbaum B，et al.The origin of The recent swine influenza a （H1N1） virus infecting humans[J].Euro Surveillance，2009，14（17）：19 193.

（收稿日期：2016-12-08） （本文編輯：周亞杰）