6 種食用菌子實體水提物對腸道菌群的影響

趙睿秋，馬高興，楊文建，裴 斐，趙立艷，胡秋輝,*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

6 種食用菌子實體水提物對腸道菌群的影響

趙睿秋1，馬高興2，楊文建1，裴 斐1，趙立艷2，胡秋輝1,*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

以金針菇、香菇、黑木耳、平菇、雙孢菇、杏鮑菇6 種常見的市售食用菌子實體為研究對象，利用

Illumina MiSeq PE250二代測序平臺對腸道微生物V4區進行富集測序，分析6 種食用菌子實體水提物對糞便懸液中

腸道菌群的菌群種類和菌群結構的影響。測序結果顯示經過不同實驗組培養后，不同種類的食用菌子實體對腸道微

生物的影響各不相同，金針菇組的厚壁菌門水平較高；香菇組的擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、雙歧桿菌和乳桿

菌水平較高；黑木耳組的擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、雙歧桿菌和乳桿菌水平較高；平菇組的擬桿菌門、放線

菌門、厚壁菌門和乳桿菌水平較高；雙孢菇組的擬桿菌門、放線菌門水平較高；杏鮑菇組的放線菌門水平較高。

食用菌子實體；腸道微生物；厭氧培養；高通量測序技術

人類的皮膚和身體黏膜表面寄生著很多微生物，它們組成了多個復雜的生態系統，而在這其中人體腸道是最龐大最復雜的生態系統。一個健康成年人的腸道內居住著400～500 種具有代謝活性的腸道菌，它們的數量在糞便中高達1011～1012CFU/g[1]。在宿主生活早期，微生物群誘導腸道免疫系統識別無害與有害細菌，建立兩者間的平衡，維護腸道健康，腸道菌群結構的變化直接影響和決定著機體的健康狀況[2]。研究發現腸道微生物基因組中富含參與碳水化合物、氨基酸、維生素等營養物質代謝的基因，其中大部分都是人體自身所不具備的[3]。早期生活因素很大程度地影響了人腸道微生物群的構成，這些因素也可能是腸道發育和疾病的誘因。有研究比較了美國、委內瑞拉和馬拉維人的腸道細菌種屬和全部功能基因的重要不同點，這些不同點在3 歲之后變得明顯[4]。

腸道菌群包括益生菌和潛在致病菌，正常情況下兩類菌保持平衡，當平衡被打破的時候，身體可能會產生比腹瀉更微小的變化以警示我們，如生長速率變慢、皮膚變差、炎癥加重、易受感染以及健康難以維持。雙歧桿菌和乳酸桿菌是最具代表性的兩種益生菌，它們在保持人的腸道正常微生物菌群平衡方面發揮重要作用[5]。雙歧桿菌和乳酸桿菌通過與其他腸道菌共同占據腸膜表面形成一個生物學屏障，構成腸道定植的阻力，從而阻止致病菌和條件致病菌的入侵[6-7]。潛在致病菌是正常菌群的一部分，在平衡狀態下不會對人體的健康造成損害，但是一旦腸道菌群失去平衡，就會導致它們大量增殖或者轉移到腸道以外的其他部位，進而引起感染，誘發疾病，嚴重的甚至會引起死亡[8]。擬桿菌、腸球菌、腸桿菌和梭狀芽孢桿菌都屬于潛在致病菌。腸道菌群的變化可以反映出個體的飲食變化、病理狀態（如腸道感染）、接受抗生素治療的情況和免疫抑制[9-10]。研究表明，食用添加了某些功能性成分的食物或服用藥物均可明顯改善腸道微生物的種類及數量，如全谷物對腸道菌群具有益生作用，體外發酵24 h后，全谷物樣品（燕麥、大麥、全麥、糙米、黑米）發酵液中的雙歧桿菌數量有顯著性增加[11]；利用外源酶處理薏仁后制成口服類藥物，人體攝入該藥物可改善腸道中擬桿菌門細菌的數量，擬桿菌門的數量改變進而導致了人體的皮膚狀況的改善[12]；人為攝入嗜酸乳桿菌活菌片劑，發現嗜酸乳桿菌可以減少產氣莢膜梭菌（一種條件致病菌）的數量[13]；車前子多糖在小鼠結腸中的發酵可以顯著增加總短鏈脂肪酸的含量，增加小鼠糞便持水力，降低結腸pH值，有利于結腸的健康[14]。

食用菌子實體是人類可食用的大型真菌的統稱，營養豐富，含有多種生理活性物質[15]。其中食用菌子實體多糖在調節生理功能和抗病、治病方面受到了舉世矚目的關注，并得到廣泛的應用[16]。研究表明，來自食用菌子實體的多糖具有與功能性低聚糖類似的可以調節腸道微生物的作用，主要通過促進有益菌群的增殖和產酸，同時抑制腸道病原菌群來發揮作用[17-18]。富硒猴頭菇凍干粉可使小鼠腸道中雙歧桿菌和乳桿菌數量顯著增多并且大腸埃希氏菌數量明顯減少，證明富硒猴頭菇凍干粉對小鼠腸道菌群具有調節作用[19]。香菇酶解物可以提高小鼠的免疫功能，改善腸道菌群環境，提高以乳酸菌為主體的有益菌的數量，降低大腸桿菌的數量，對腸道功能有一定的調節作用[20]。靈芝多糖可以通過調節小鼠腸道微生物的群落結構來改善和降低小鼠的肥胖率[21]。但是關于系統地比較多種食用菌子實體之間對腸道微生物的作用差異鮮見報道。因此，本實驗對6 種常見的市售食用菌子實體對腸道微生物群落結構和豐度的影響進行了研究，系統地比較了6 種食用菌子實體之間的作用差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雙孢菇、黑木耳、平菇、香菇、金針菇、杏鮑菇采購于南京眾彩農貿市場。

基礎培養基[22]：NaCl 0.1 g/L、KH2PO40.04 g/L、K2HPO40.04 g/L、MgSO4·7H2O 0.01 g/L、CaCl2·2H2O 0.01 g/L、NaHCO32 g/L、氯化血紅素0.05 g/L、半胱氨酸0.5 g/L、膽汁酸鹽0.5 g/L、吐溫-80 2 mL/L、樹脂天青0.001 g/L、VK 10 μL/L。

細菌DNA提取試劑盒D3350-1 美國Omega試劑公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DS-1高速組織絞碎機 上海標本模型廠；EYELA N-1000D-WD旋轉蒸發儀 廣州艾欣科學儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海右一儀器有限公司；5-2A數顯測速恒溫磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；YQX-1型厭氧手套箱 上海躍進醫療器械廠；llegra TM 64R Centrifuge離心機 美國Beckman公司；HH系列數顯恒溫水浴鍋 上海江星儀器有限公司；電子萬用爐 銘陽電熱電器廠。

1.3 方法

1.3.1 食用菌子實體水提物的制備

取新鮮食用菌子實體原料清水洗凈，絞碎，加入兩倍體積的蒸餾水，55 ℃水浴加熱2 h后，過濾并收集濾液。將濾液低溫濃縮、冷凍干燥，得到食用菌子實體水提物。

1.3.2 食用菌子實體水提物成分測定

蛋白質含量測定采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》自動凱氏定氮儀法；總糖含量測定采用GB/T 15672—2009《食品中總糖含量的測定》；水分含量測定采用GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》。

1.3.3 厭氧培養基的配制

首先分別稱取0.24 g黑木耳、平菇、香菇、金針菇、杏鮑菇、雙孢菇水提物至6 個三角瓶中，各加入0.18 g菊糖；陽性對照選擇牛肉膏和魚粉，分別稱取0.12 g牛肉膏粉、魚粉至兩個三角瓶中，各加入0.3 g菊糖；最后在每個三角瓶中添加30 mL基礎培養基，121 ℃、高壓滅菌2 h備用。

1.3.4 腸道微生物培養液的配制

選擇1 位22 歲男性受試者，身體狀況良好、健康，且2 個月內未服用過抗生素。收集受試對象的新鮮全便，混合均勻后稱取3 g并加入30 mL經脫氧處理的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），放入離心機中離心（550 r/min；5 min）制成糞便懸液后立即放入厭氧手套箱。

1.3.5 腸道微生物的培養

在厭氧手套箱中接種糞便懸液：在4 mL離心管中加入0.3 mL糞便懸液和2.7 mL厭氧培養基（實驗組和陽性對照組均為2.7 mL），充分搖勻。放入厭氧手套箱中的恒溫室進行培養。每12 h上下顛倒搖勻一次。培養48 h后開箱取樣[23-24]。

1.3.6 腸道微生物DNA的提取與分離

參照Omega細菌DNA提取試劑盒說明書對腸道微生物DNA進行提取分離。提取后的樣品放置－20 ℃保存[25]。

1.3.7 樣品的測序分析

將引物接頭連接到DNA片段上，經聚合酶鏈式反應擴增后制成基因組文庫，隨后在含有接頭（單鏈引物）的芯片（flowcell）上將已加入接頭的DNA片段變成單鏈后通過與單鏈引物互補配對綁定在芯片上，另一端和附近的另外一個引物互補也被固定。經30 輪擴增反應，形成單克隆DNA簇。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4 種熒光標記的dNTP。用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團化學切割，恢復3’端黏性，繼續聚合第二個核苷酸，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。統計每輪收集到的熒光信號結果，檢測出每個模板DNA片段的序列[26]。

1.4 統計學分析

2 結果與分析

2.1 食用菌子實體水提物的得率

食用菌子實體水提物的得率如下：金針菇：3.37%；黑木耳：1.71%；平菇：2.22%；雙孢菇：2.34%；香菇：2.67%；杏鮑菇：3.67%。

2.2 食用菌子實體水提物成分測定結果

表 1 水提物成分及含量Table 1 Composition of mushroom water extracts

從表1可以看出，不同種類的食用菌子實體水提物中粗蛋白和總糖的含量各不相同，香菇中粗蛋白含量最多，黑木耳中粗蛋白含量最少；黑木耳中總糖含量最多，雙孢菇中總糖含量最少。水提物中粗蛋白含量在18%～31%之間，總糖含量在26%～49%之間。水提物中總糖和粗蛋白含量之和占總量的50%～70%。此外水提物中還含有10%～15%的水分。

2.3 總序列數及各樣品序列數據統計

在測序實驗中，通常采用多個樣品平行測序的方法，即多個樣品混合測序。為了能區分樣品，各樣品中的序列均引入了一段標示其樣本來源信息的barcode標簽序列。若所測序列中不含有barcode標簽序列，則無法確定其樣本來源。因此，僅當原始序列中含有完整的barcode標簽序列時，該條序列才被認可為該樣品的序列。由于MiSeq采用雙末端測序，需要對數據進行合并，使用Fastx軟件去掉序列末尾質量低于Q15的堿基并使用Flash軟件對數據進行合并；在實驗過程中，測序產物可能含有非特異性擴增片段，利用特異性引物信息可以將其去除。本次分析將barcode序列去除，并對處理后的有效序列進行數據及長度分布統計。本次測序共有8 個樣品，總序列數為334 231，總堿基對數為152 570 723 bp，平均堿基對數為456.5 bp。而有效序列大多分布在441～460 bp和461～480 bp，少量分布在1～440 bp和481～520 bp。

通常情況下，有效序列可以直接用于后續生物信息學分析。但如果需要得到更高質量及更精準的生物信息分析結果，則應對有效序列進行去雜。為了進一步保證序列準確性，對后引物也按不超過2 個堿基錯配進行過濾；序列中可能含有長度過短的序列，將這些序列納入分析范圍會降低分析質量，因此修剪、去除此部分序列，可得到供精準分析的優化序列；最后需要剔除總堿基錯誤率高于1的序列。金針菇組的有效序列為29 281 bp；黑木耳組的有效序列為47 332 bp；平菇組的有效序列為44 266 bp；雙孢菇組的有效序列為37 576 bp；香菇組的有效序列為47 502 bp；杏鮑菇組的有效序列為44 971 bp；牛肉膏組的有效序列為42 037 bp；魚粉組的有效序列為41 266 bp。

2.4 各樣品群落結構分析

圖 1 群落結構分析柱狀圖Fig. 1 Histogram analysis of the microbial community structure

表 2 組間顯著性差異分析表Table 2 Signif i cant difference analysis between different groups

從圖1和表2可以看出，就腸道菌群相對含量而言（以4 種門類腸道微生物總數為100%），8 個樣品中的2 個陽性對照組（牛肉膏和魚粉）培養出的腸道菌群群落結構基本相似，而6 種食用菌子實體水提物樣品處理組所培養出的腸道菌群的群落結構組成與對照有明顯差異。牛肉膏和魚粉組中放線菌門細菌所占比例明顯高于食用菌子實體水提物；變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門細菌所占比例明顯低于食用菌子實體水提物，說明食用菌子實體水提物較常用氮源來說，明顯改變了腸道微生物的群落結構。

P值即為假陽性概率值，當P＜0.05時可認為差異顯著；q值是假發現率評估值，代表本次計算的可信度。由表2可以看出，除了金針菇、平菇組與雙孢菇組變形菌門微生物無顯著性差異外，其余各組食用菌子實體在4大門類微生物水平上均有顯著性差異。

2.5 菌群分類學分析

圖 2 全樣品相似度樹形圖Fig. 2 Dendrogram showing the similarity of intestinal microbial communities from different groups

根據JEST（Jaccard coefficient using richness estimators）算法計算樣品的相似性并以樹圖形式展示。在樹圖中距離越近的樣品，其對腸道微生物的群落種類影響結果越相似。從圖2可以看出，添加了黑木耳和杏鮑菇水提物的實驗組在腸道微生物群落結構上最為相近；其次是平菇組，與黑木耳和杏鮑菇組的作用結果較為接近，雙孢菇和香菇組的作用結果較為接近，而金針菇組與其余各組中的腸道微生物群落結構差異最大，在對腸道微生物的作用結果上與其余各組相比差距較大。

表 3 主要細菌組成及豐度統計表Table 3 Major species and abundance of intestinal microorganisms

放線菌門的大多數細菌為有益菌，如雙歧桿菌，可產生抗生素、各種酶（蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等）、VB12和有機酸等活性物質。雙歧桿菌分布在胃腸的數量隨年齡階段的增長而減少。已經發現，雙歧桿菌有32 個亞型。嬰兒腸道中雙歧桿菌占總腸道菌的60%，60 歲以上老人雙歧桿菌只占7.9%。已有研究發現雙歧桿菌有如下藥理作用：維護腸道正常細菌菌群平衡，抑制病原菌的生長，防止便秘和胃腸障礙，同時雙歧桿菌可在腸道內合成維生素、氨基酸，提高機體對鈣離子的吸收[27]。從表3可以看出，實驗組的雙歧桿菌數量總體較對照組低，在實驗組中，香菇組的雙歧桿菌數量最多，其次是黑木耳組。推測香菇、黑木耳中含有可以促進雙歧桿菌增殖的活性物質，進而對人體健康產生有益的影響。

乳酸菌是一類人體腸道中常見的益生菌。在乳酸菌中，乳酸桿菌是最大的一個屬。乳酸桿菌屬是動物和人類腸道中占優勢的菌群之一。乳酸桿菌的生理功能主要表現為：阻止病原菌對腸道的入侵和定植，維持腸道的微生態平衡，預防和抑制腫瘤的發生，增強機體免疫力，促進消化，合成氨基酸和維生素，降低膽固醇，抑制內毒素的生產，延緩衰老和抗輻射等[28]。大量事實證明，只要腸道中乳酸桿菌的數量減少或消失，出現菌群失調，就可能導致某種疾病的發生；只要腸道中乳酸桿菌的數量增加，區系得到平衡，就可以促進機體健康和治療某種疾病[29]。從表3可以看出，金針菇、黑木耳、平菇、香菇組中乳酸桿菌水平較高，杏鮑菇相對較少，雙孢菇最少，可推測金針菇、黑木耳、平菇、香菇中含有促進乳酸桿菌增殖的活性物質，多食該類食用菌子實體可促進乳酸桿菌在腸道中的增殖，預防和減少疾病的發生。

腸內厚壁菌門總數多于擬桿菌門總數將促使人體更有效吸收食物中的熱量從而導致肥胖[30]。從圖1可知，只有雙孢菇所培養出的產物中厚壁菌總數明顯少于擬桿菌總數，因此多食用雙孢菇能有利于人體控制熱量的吸收進而達到減肥的目的。

變形菌能引起尿道感染和機體其他部位的腐敗性損傷，大腸桿菌、埃希氏菌和克雷伯氏桿菌均屬于變形菌。從表3可知，只有香菇組中埃希氏菌和克雷伯氏桿菌水平較高，而其余幾組食用菌子實體培養的產物中，變形菌總數所占比例則較低，說明食用菌子實體可能對抑制炎癥的產生具有一定的效果。

綜合表3及上文分析可知，金針菇組的厚壁菌門水平較高；香菇組的擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、雙歧桿菌和乳桿菌水平較高；黑木耳組的擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、雙歧桿菌和乳桿菌水平較高；平菇組的擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門和乳桿菌水平較高；雙孢菇組的擬桿菌門、放線菌門水平較高；杏鮑菇組的放線菌門水平較高。

3 結 論

本研究用金針菇、黑木耳、平菇、雙孢菇、香菇、杏鮑菇提取物培養腸道微生物，6 種食用菌子實體所培養出的腸道微生物中，菌落種類無明顯差異，但是菌落結構發生了明顯的變化。統計學結果顯示不同種類微生物對腸道微生物的影響結果差異顯著。黑木耳與杏鮑菇群落結構組成最為相似，其次是平菇，三者較為接近；雙孢菇和香菇群落組成相似。不同種類的食用菌子實體水提物粗蛋白、還原糖含量均不相同，對腸道微生物的影響也各不相同。其中實驗組雙歧桿菌和假鏈雙歧桿菌總體水平較陽性對照組低，香菇和黑木耳組中的雙歧桿菌水平較高，說明香菇和黑木耳可以促進雙歧桿菌的增殖；金針菇、黑木耳、平菇、香菇組的乳酸桿菌水平較高，長期食用金針菇、黑木耳、平菇、香菇可以增加腸內乳桿菌的數量，預防和減少疾病的發生；雙孢菇組中的擬桿菌數目普遍較多，且明顯多于厚壁菌，可降低肥胖的發生率，擬桿菌大多屬于正常寄生菌，對健康無不良影響；香菇組中埃希氏菌和克雷伯氏桿菌數目明顯較多，腸球菌數目最多，這類細菌都是條件致病菌，一定條件下可誘發炎癥及感染，而黑木耳組中的克雷伯氏桿菌數目及變形菌總數相對較少，黑木耳具有抗炎癥和抗感染的效果。

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Effects of Water Extracts from Six Different Species of Edible Mushroom on Intestinal Microorganisms in Humans

ZHAO Ruiqiu1, MA Gaoxing2, YANG Wenjian1, PEI Fei1, ZHAO Liyan2, HU Qiuhui1,*
(1. Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

This study researched the effects of water extracts from six different species of edible mushroom, Flammulina velutipes, Lentinus edodes, Auricularia auricula, Pleurotus ostreatus, Agaricus bisporus and Pleurotus eryngii, on the microbial community composition and structure in the human intestine. Towards this goal, MiSeq PE250 Illumina nextgeneration sequencing platform was used to identify the sequence of the 16S rDNA V4 region from the bacterial cells. Sequencing results showed that different species of edible mushrooms had different impacts on the intestinal mictrobiota. Higher populations of Firmicutes were found in the Flammulina velutipes group, Bacteroidetes, Proteobacteria, Firmicutes, Bif i dobacterium and Lactobacillus in the Lentinus edodes group, Bacteroidetes, Actinomycetes, Firmicutes, Bif i dobacterium and Lactobacillus in the Auricularia auricular group, Bacteroidetes, Actinomycetes, Firmicutes and Lactobacillus in the Pleurotus ostreatus group, Bacteroidetes and Actinomycetes in the Agaricus bisporus group, and Actinomycetes in the Pleurotus eryngii group.

edible mushroom; intestinal microorganism; anaerobic culture; high throughput sequencing technology (HTS)

10.7506/spkx1002-6630-201705019

TS201.3

A

1002-6630（2017）05-0116-06

趙睿秋, 馬高興, 楊文建, 等. 6 種食用菌子實體水提物對腸道菌群的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(5): 116-121. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705019. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Ruiqiu, MA Gaoxing, YANG Wenjian, et al. Effects of water extracts from six different species of edible mushroom on intestinal microorganisms in humans[J]. Food Science, 2017, 38(5): 116-121. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705019. http://www.spkx.net.cn

2016-07-30

國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-24）

趙睿秋（1992—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：1037486623@qq.com

*通信作者：胡秋輝（1962—），男，教授，博士，研究方向為農產品加工與營養。E-mail：qiuhuihu@njue.edu.cn