阿司匹林對人宮頸癌Hela細胞BCL-6mRNA表達的影響

張 潔 石小風 諶新興 賈 靜

1.吉首大學醫學院，湖南 吉首 416000；2.湘西自治州人民醫院，湖南 吉首 416000

阿司匹林對人宮頸癌Hela細胞BCL-6mRNA表達的影響

張 潔1石小風2諶新興1賈 靜1

1.吉首大學醫學院，湖南 吉首 416000；2.湘西自治州人民醫院，湖南 吉首 416000

目的：研究阿司匹林對人宮頸癌Hela細胞增殖及BCL-6 mRNA 表達量的影響。方法：不同劑量的阿司匹林干預人宮頸癌 Hela細胞24h后，用MTS法觀察其對人宮頸癌 Hela細胞增殖狀態的影響及采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 檢測阿司匹林作用后 Hela 細胞 BCL-6 mRNA 量的變化。結果：阿司匹林能抑制Hela細胞增殖及促進細胞中 BCL-6 mRNA 的表達，且促進強度隨阿司匹林的濃度的增加而增加。結論：阿司匹林能夠抑制人宮頸癌Hela細胞的生長，并從 mRNA 水平促進 BCL-6 蛋白的表達。

阿司匹林；人宮頸癌 Hela 細胞；BCL-6

阿司匹林屬于非甾體抗炎藥的代表藥，是臨床上常用的解熱鎮痛藥。研究發現長期低劑量服用阿司匹林具有預防腫瘤的作用[1]，對腸癌細胞系、乳腺癌、胰島瘤NIT-1細胞、宮頸癌Hela細胞等均有抑制作用[2-4]。宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其全球發病率位居女性惡性腫瘤中第2位[5]。其發病是一個多因素、多步驟級連的過程[6]，發病機制尚未完全闡明。BCL-6基因(B cell lymphoma 6，簡稱 BCL-6)是Ye等[7]在 1993年研究非霍奇金淋巴瘤免疫基因圖譜時發現的一種原癌基因。在生理條件下，BCL-6 主要表達于生發中心 B 細胞和 CD4T 細胞，調節B細胞活化及分化相關基因如 blimp-1、CD4等[8]、細胞周期調控基因如p27kip1、cyclinD2、炎癥有關的趨化因子基因如MIP-1a 和 IP-10[9]的表達。大量研究發現[10-12]發現BCL-6 在多種腫瘤中表達量增加，并且與腫瘤的增殖、侵襲和遷移密切相關。由于BCL-6與腫瘤密切相關，所以我們推測阿司匹林可能通過促進BCL-6的轉錄表達來抑制宮頸癌Hela細胞的增殖。本研究通過觀察阿司匹林對人宮頸癌 Hela 細胞 BCL-6 mRNA 表達的影響來探究宮頸癌的發病機制。

1 儀器與材料

1.1 細胞 人宮頸癌 Hela 細胞株，購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 試劑和藥品 RPMI-1640培養基(Gibco公司)；青霉素-鏈霉素混合溶液(100×雙抗，Gibco公司)；胎牛血清 (FBS，Gibco公司)；二甲基亞砜 (DMSO，Sigma公司)； 0.02% EDTA/0.25% 胰蛋白酶(Gibco公司)；Trizol (Invitrogen公司)；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(promega公司)；GoTaq 2-Step RT-qPCR System (Promaga公司)；其它試劑均為國產分析純。

1.3 儀器 二氧化碳培養箱(美國thermo公司)；BX51倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)； NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)；T100 Thermal Cycler PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Eco熒光定量PCR系統(美國Illumina公司)。

1.4 藥物 Aspirin(貨號：A2093，SIGMA公司)。

2 方法

2.1 阿司匹林溶液的配制與人宮頸癌 Hela 細胞培養

2.1.1 阿司匹林溶液的配制 將40mL完全培養基放至 50mL的離心管中備用；再用電子天平準確稱取72.064g的阿司匹林粉末(分子量為 180.16)，溶于準備好的 40mL完全血清培養基中，用震蕩混勻器充震蕩使其完全溶解，再將pH值調至 7.1～7.2，即得 1mol/L 的阿司匹林母液，隨后轉移至超凈臺用 0.22μm 的微孔過濾器過濾除菌，分裝至小離心管中，置于-20℃冰箱保存，使用時予完全培養基稀釋至不同濃度的阿司匹林2.5、5.0、10.0、20.0mmol/L。

2.1.2 人宮頸癌 Hela 細胞培養 人宮頸癌 Hela細胞于37℃、飽和濕度、 5% CO2條件下貼壁培養，經0.25%的胰蛋白酶常規消化后按一定量接種至RPMI-1640培養基(含10% FBS，1%雙抗)中吹散均勻，移入新細胞培養皿，于培養箱中繼續培養，每3～4d傳代1次，每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

2.2 MTS法檢測不同濃度阿司匹林對HeLa細胞的生長抑制率 取處于對數生長期的人宮頸癌 Hela細胞經0.25%的胰蛋白酶常規消化后按按1×104個/孔接種于96孔板內，每孔200μL，接種完畢后，將板置于37℃，含5% CO2的培養箱中貼壁過夜，24h 后，更換培養基為無血清培養基培養24h 后開始進行分組加藥，空白組及對照組再分別加入200μL完全培養基，加藥組分別加入不同濃度阿司匹林的完全培養基各200μL，每組設5個復孔,加藥完畢繼續于培養箱中培養；培養24h后,將板取出,每孔加入40μL MTS溶液，繼續培養1～4h取出96孔板，用酶標儀測定490nm波長處的吸光度，實驗重復3次。計算細胞的生長抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD 值)×100%。

2.3 qRT-PCR 檢測阿司匹林對HeLa 細胞中BCL-6 mRNA表達的影響 取處于對數生長期的細胞如前常規消化后按1×106個/孔接種于6孔板內，每孔2mL，接種完畢后，將板置于37℃，含 5%CO2的培養箱中貼壁過夜。次日，分別加藥入不同濃度阿司匹林的完全培養基各2mL，對照組加入2mL完全培養基，加藥完畢繼續于培養箱中培養。取出細胞提取總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計測定的RNA的濃度與純度。按GoTaq 2-Step RT-qPCR System說明書進行逆轉錄(反應體系20μL，逆轉錄反應條件：25℃×10min，42℃×60min，70℃×15min，4℃×5min)以及qPCR(反應體系20μL,反應條件：擴增反應條件：95℃×2min,95℃×15sec,60℃×60sec，總共45個循環)，實驗重復3次。qPCR引物由北京市金瑞斯生物技術有限公司設計并合成，基因引物見表1。采用相對定量法(2-ΔΔCT法)計算目的mRNA相對表達量。

表1 RT- PCR 實驗引物序列

3 結果

3.1 阿司匹林對HeLa細胞生長抑制率的影響 MTS結果顯示，不同濃度的阿司匹林(2.5、5.0、10.0、20.0mmol/L)作用HeLa細胞24h后能抑制HeLa細胞的增殖，與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性，即其抑制率隨濃度的增大而逐漸增加。見圖1、表2。

表2 阿司匹林對HeLa細胞作用24h生長的影響±s)

組別濃度/mmol/LA/吸光度抑制率/%對照組-1 88±0 37-阿司匹林組2 5mmol/L1 57±0 2316 1±3 1?5 0mmol/L1 52±0 1319 2±2 8?10 0mmol/L1 47±0 1721 6±3 8??20 0mmol/L1 38±0 2826 5±3 3?

注： 與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 阿司匹林對HeLa細胞中BCL-6 mRNA表達的影響 qRT-PCR結果顯示，不同濃度的阿司匹林(0、2.5、5.0、10.0、20.0mmol/L)作用HeLa細胞24h后能促進HeLa 細胞中BCL-6 mRNA表達，與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性，即其促進程度隨濃度的增大而逐漸增加。見圖2。

4 討論

原癌基因BCL-6屬于抗細胞凋亡家族，編碼核轉錄抑制蛋白，在生發中心B細胞和具有生發中心B細胞表型的淋巴瘤中高表達。BCL-6的主要功能是轉錄抑制作用，受BCL-6調控的靶基因主要與細胞活化、分化和增生相關。研究發現BCL-6在多種腫瘤中有高表達，且與腫瘤的增殖、侵襲等密切相關[10-12]。BCL-6在彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤等淋巴瘤中顯著高表達，且已成為彌漫大B細胞淋巴瘤的診斷標志物之一[13-14]。

宮頸癌是發生在全球婦女中僅次于乳腺癌的第二常見的惡性腫瘤。我國宮頸癌發病率已高居世界第二位，僅次于智利，且發病年輕化趨勢明顯，因此研究宮頸癌的發病機制、治療、預防是一大熱點。目前認為宮頸癌的發病主要與HPV感染引起機體內源性因素產生影響，如相關癌基因激活、抑癌基因失活、端粒酶活性高表達和機體免疫調節機制失衡等一系列病理改變，引起細胞增殖與凋亡調節異常，導致組織癌變。阿司匹林是非甾體抗炎藥 (NSAIDs)，可以通過抑制COX和NOS-2激活等途徑來預防和抑制腫瘤的作用[15]。實驗研究[16-18]也確實證明了阿司匹林能夠抑制宮頸癌細胞的增殖與凋亡，但具體機制不詳。

基于原癌基因BCL-6與宮頸癌發生發展的相關性，本項目組進行了此次實驗，實驗結果表明阿司匹林具有明確的抗宮頸癌的作用，并且該作用可能與其促進BCL-6的表達有關。其促進作用于阿司匹林的濃度呈正相關，但是阿司匹林是如何通過促進BCL-6表達來抑制宮頸癌的還需進一步的深入研究。

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Effect of Aspirin on the Expression of mRNA BCL-6 in Human Cervical Cancer Hela Cells

ZHANG Jie1SHI Xiaofeng2CEN Xinxing1JIA Jing1

1.Medical College of Jishou University， Jishou 416000,China;2.People’s Hospital of Xiangxi Autonomous Prefecture, Jishou 416000,China

Objective To observe the inhibiting effect on aspirin on the proliferation of cervical cancer cells and on the transcription of BCL-6 in vitro.Methods Hela cells were cultured in vitro and interfered by different concentrations of aspirin for 24 hours, the proliferation of the cells were detected by MTS method and the quantity of BCL-6 mRNA were measured by using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT -PCR).Results Apirin can inhibit the proliferation of Hela cells and enhance the transcription of BCL-6 mRNA and the effect was in concentration dependent with aspirin.Conclusion Aspirin can inhibit the cells proliferation in vitro and promotes BCL-6 protein expression in the transcription level.

Aspirin; Hela Cells; BCL-6

吉首大學校級科研項目(14JD024)；吉首大學醫學類專業大學生創新訓練項目(JDYXCX201503)。

張潔(1988-)，女，苗族，碩士研究生，助理實驗師，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail:zhangjie19881003@163.com

R73-36+1

A

1007-8517(2017)05-0049-03

2016-12-23 編輯：程鵬飛)