納米銀凝膠對小鼠直腸潰瘍模型的影響

杜 蕊 段佛龍 李金璐 徐小丹 蔣大兵 秦 燕

1.大理大學基礎醫學院臨床醫專業2013級；2.大理大學基礎醫學院醫學檢驗專業2013級；3.大理大學基礎醫學院生理與病理生理學教研室，云南 大理 671000

納米銀凝膠對小鼠直腸潰瘍模型的影響

杜 蕊1段佛龍2李金璐1徐小丹2蔣大兵2秦 燕3*

1.大理大學基礎醫學院臨床醫專業2013級；2.大理大學基礎醫學院醫學檢驗專業2013級；3.大理大學基礎醫學院生理與病理生理學教研室，云南 大理 671000

目的：觀察納米銀凝膠治療右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠直腸潰瘍的有效性。方法：30只昆明小鼠隨機分為3組，每組10只。模型組、治療組小鼠自由飲用4% DSS溶液，連續7d，同時給予對照組飲用冷卻白開水。第8天，治療組小鼠行納米銀凝膠灌腸治療(0.1mL/只·d)，其余小鼠給予等量單純凝膠灌腸，共7d。每天監測小鼠體重，大便性狀和隱血情況。后處死小鼠，HE染色觀察直腸組織的病理學改變。結果：納米銀凝膠治療7d后，治療組小鼠體重增加，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；直腸炎疾病活動指數評分模型組小鼠在治療前后無統計學差異(P>0.05)，而治療組小鼠的評分值在治療前后有統計學差異(P<0.05)。病理形態學顯示：模型組小鼠直腸黏膜上皮壞死脫落，可見明顯潰瘍灶，而治療組小鼠直腸形態明顯改善。結論: 納米銀凝膠對小鼠直腸潰瘍具有一定的治療作用，為納米銀凝膠拓展新用途提供了理論依據。

納米銀；直腸潰瘍；治療效果

隨著人們生活習慣、飲食結構的改變，直腸潰瘍在我國的發病率呈逐年增加的趨勢[1]。但直腸潰瘍的發病機制尚不清楚，大多學者認為是局部直接損傷或各種原因引起的局部缺血所致，常伴有感染及菌群失調。若直腸潰瘍經久不愈還有惡變的可能。調查發現直腸癌往往以直腸潰瘍為始動因素[2]，因此直腸潰瘍應引起人們的高度重視。

納米銀(Nano Silver)是利用前沿納米技術將銀納米化，其可產生強大的殺菌作用，且具有廣譜性和無耐藥性，其次還能促進傷口的愈合、細胞的生長及受損細胞的修復等[3]，目前在臨床上被應用于治療婦科疾病、口腔潰瘍、燒傷等。基于此，本研究通過建立直腸潰瘍小鼠模型，觀察納米銀的治療作用，為擴展納米銀在臨床上的用途提供一定的理論依據，為直腸潰瘍的治療提供新的策略。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物 昆明種小鼠。級別：SPF；動物合格證號：SCXK(川)2015-030。體重18～22g，雌雄不限，購自大理大學實驗動物中心。

1.2 材料 AGS-NM400納米銀凝膠(批號：15102804501；Ag含量≥400ppm；pH(7.0±0.5)；粒徑15nm；密度1.20g/mL；上海滬正納米科技有限公司)；NJ-001單純凝膠(批號：15102804501；上海滬正納米科技有限公司)；DSS(MW:35000～50000，上海翊圣生物科技有限公司)；隱血試紙(珠海貝索生物技術有限公司)，甲醛、蘇木素-伊紅染液、二甲苯等試劑均為分析純。

1.3 儀器 KD-MB生物組織包埋機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；YR-18全自動染色機(孝感市亞光醫用電子技術有限公司)；HM315石蠟切片機(德國 MICROM GmbH)；菜斯AXIOSKOP20多功能顯微鏡(蔡司遠東有限公司)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，自制小鼠灌腸裝置(1mL注射器、頭皮針)[4]。

2 方法

2.1 實驗分組及模型制備 取30只昆明小鼠常規飼養，適應環境飼養3d后，隨機分為正常對照組(對照組)、直腸潰瘍模型組(模型組)及納米銀凝膠治療組(治療組)，每組10只。模型組和治療組小鼠自由飲用4% DSS(分子量:35000～50000)溶液，連續7d[5]，同時給對照組小鼠自由飲用冷卻白開水。第8天，治療組小鼠開始給納米銀凝膠灌腸(0.1mL/只)，1次/d，而對照組、模型組小鼠以相同方式給等量單純凝膠灌腸，連續治療7d。

2.2 疾病活動指數評分(Disease Activity Index，DAI) 參照Cooper HS等[6-7]的方法，每天定時監測小鼠體重，觀察小鼠糞便性狀(成形顆粒樣便記為正常；糊狀或不成形不糊肛便記為松散；水樣糊肛便記為稀便)，大便隱性或顯性出血情況，進行疾病活動指數評分。見表1。

表1 小鼠結直腸炎疾病活動指數評分

2.3 直腸病理形態學觀察 實驗結束后，處死小鼠，取距肛門相同距離(1cm)處同一部位組織(2mm×10mm)，4%甲醛固定，常規石蠟包埋、切片(4μm)，HE染色，盲法閱片，觀察其組織學損傷程度及修復情況。

2.4 統計學處理 數據采用SPSS19.0進行統計分析，小鼠疾病活動指數評分值和體重變化量各組比較用q檢驗、組內比較用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠體重變化情況 小鼠直腸潰瘍模型建立初期(前4d)，3組小鼠體重變化量不大(P>0.05)。建模第5天，模型組與治療組小鼠體重下降明顯，與對照組比較差異均有統計學意義 (P<0.05)；而模型組與治療組比較，小鼠體重變化量無統計學差異 (P>0.05)，見表2、圖1。經納米銀凝膠治療后，治療組小鼠體重下降趨勢減緩，并有上升，與模型組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3、圖2。(注：xn-x0表示各組小鼠試驗期每天的平均體重與試驗前起始平均體重的差值，該計算方法可有效的表示小鼠在試驗期間的體重變化趨勢。)

表2 模型建立期間各組小鼠平均體重變化量(xn-x0)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，○P>0.05。

表3 治療期間各組小鼠平均體重變化量(xn-x0)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，○P<0.05。

3.2 疾病活動指數評分 建模7d后，模型組與治療組小鼠直腸炎疾病活動指數評分值均增高，與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；而治療組與模型組小鼠直腸炎疾病活動指數評分無統計學差異 (P>0.05)。治療7d后，模型組小鼠直腸炎疾病活動指數評分值與治療前比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而治療組小鼠直腸炎疾病活動指數評分值較治療前明顯減小，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表4。

3.3 各組小鼠直腸組織病理形態學變化 模型組黏膜上皮壞死脫落形成潰瘍灶，組織間隙明顯水腫，腺體結構模糊，伴大量炎細胞浸潤；治療組黏膜上皮延伸生長，再生修復，不同程度的組織水腫和充血減輕，炎細胞浸潤減少；對照組黏膜、黏膜下層及肌漿層均完整，無明顯病變。見圖3。

表4 各組小鼠直腸炎疾病活動指數評分(分，x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與治療前比較，□P<0.05。

4 討論

直腸潰瘍(Rectal ulcers)是指局限于直腸粘膜及粘膜下層的炎癥過程，多位于乙狀結腸和直腸，也可延伸至降結腸，甚至整個結腸。其臨床癥狀常呈間斷性腹部隱痛、肛門下墜、粘液膿血便等。該病往往反復發作長達數月、數年乃至數十年，給患者身心造成極大痛苦[8]。臨床上多用水楊酸柳氮磺胺類藥物和腎上腺糖皮質激素等來治療直腸潰瘍，有一定療效[9]。但上述藥物不良反應較多，且易引發二重感染和產生細菌耐藥性。因此亟待尋找新的更有效的藥物進行治療。

銀作為一種優良的天然抗菌劑，已經有幾個世紀的應用史，其應用形式主要包括銀離子、銀單質和銀復合物。納米銀(Nano Silver)是利用前沿納米技術將銀納米化，使其具有極大的比表面積,，增強了納米銀與微生物之間的相互作用，與其他形式的銀相比具有更強的抗菌活性。納米銀還可以在細菌細胞內持續釋放銀離子，使其抗菌活性更持久[10]。此外納米銀還能促進傷口的愈合、細胞的生長及受損細胞的修復，且對人體毒副作用極小，不易產生耐藥性[11]。這些特點使納米銀成為臨床創傷治療的研究熱點之一。目前在臨床上已被廣泛應用于治療婦科疾病、口腔潰瘍、燒傷等。研究通過建立直腸潰瘍的小鼠模型，觀察納米銀對其的治療效果。

直腸粘膜慢性炎癥改變和潰瘍形成是直腸潰瘍的主要病理特征，故疾病活動指數、體重變化及直腸組織形態學觀察是了解直腸潰瘍治療是否有效的重要指標。研究結果顯示：模型組、治療組小鼠于建模7d后出現稀便、大便隱血實驗陽性及血便，并伴有明顯體重下降，說明小鼠直腸潰瘍的模型建立是成功的。之后治療組用納米銀凝膠連續治療7d，小鼠體重下降幅度逐漸減緩并有上升趨勢，大便性狀好轉，隱血實驗轉陰，無血便。與治療前比較，治療組疾病活動指數評分值明顯減小，表明納米銀凝膠對小鼠直腸潰瘍有一定的治療作用。直腸病理形態學顯示：模型組黏膜上皮壞死脫落形成潰瘍灶，組織間隙明顯水腫，腺體結構模糊，伴大量炎細胞浸潤；而納米銀凝膠治療后，小鼠直腸黏膜上皮延伸生長修復，固有層大量肉芽組織及瘢痕組織增生取代壞死組織，不同程度的組織水腫和充血減輕，炎細胞浸潤減少，表面納米銀凝膠對小鼠直腸潰瘍具有一定的抗潰瘍和修復作用。

綜上所述，納米銀凝膠對小鼠直腸潰瘍具有一定的治療作用，但具體機制還有待進一步研究。

[1]周慧聰.孤立性直腸潰瘍綜合征[J].國際消化病雜志，2010,30(6):335-337.

[2]劉斌，陽惠湘.潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌的危險因素及預防[J].國際病理科學與臨床雜志，2012,32(3):244-252.

[3]于曉旭，鮑會靜，徐晨，等.納米銀抗菌作用機制：劑量依賴性促進細菌凋亡[J].中國組織工程研究，2015(38)：6173-6178.

[4] 廣布加甫·藏登，布圖雅.灌腸療法研究中小鼠灌腸器的制作與應用[J].亞太傳統醫藥，2014(6):29-30.

[5] 張忠,程富勝,賈寧,等.小鼠潰瘍性結腸炎模型的建立及病理組織學比較[J].中國實驗動物學報，2012,20(6):69-72.

[6] Cooper HS,Murthy SN,Shah RS,et al.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis[J].Lab lnvest 1993;69(2):238-249.

[7] Murano M,Maemura K,Hirata I,et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappaB(p65) antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium (DSS) induced colitis[J].Clin Exp lmmunol，2000，120:51-58.

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[9] 方凱,王藝宙,王慧,等.益生菌治療潰瘍性結腸炎的研究進展[J].藥物生物技術，2014,21(3):270-273.

[10] 吳宗山,胡海洋,任藝,等.納米銀的抗菌機理研究進展[J].化工進展，2015,34(5):1349-1356.

[11] 劉煥亮,王慧杰,襲著革.納米銀的抗菌原理及生物安全性研究進展[J].環境與健康雜志，2009,26(8):736-739.

Effect of Nano Silver gel on rectal ulcer in mice

Du Rui1DuanFulong2LiJinlu3XuXiaodan2JiangDabing2QinYan3*

1.Grade 2013 of clinical medicine, School of Basic Medicine, Dali University, Dali, Yunnan 671000; 2.Grade 2013 of Medical inspection technology, School of Basic Medicine, Dali University, Dali, Yunnan 671000; 3.Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medicine.Dali University, Dali, Yunnan 671000

Objective To observe the effect of Nano Silver gel on the rectal ulcer model induced by dextran sulfate sodium (DSS) in mice, and to extend its application in clinic.Methods 30 mice were divided into 3 groups randomly, 10 in each group.The model group and the Nano Silver gel treatment group were given free drinking 4% DSS solution for 7 days.7 days later, the mice in treatment group were received daily clysis therapy of Nano Silver gel (0.1ml), others mice were received daily equal amount pure gel for 7 days.The weight of mice, feces character and occult blood were checked every day.The mice were killed at the 8th day, The histological changes of the rectal tissue were determined by HE staining.Results After 7 days treatment of Nano Silver gel, and compared with the model group, the weight of mice in the treatment group increased markedly (P<0.05).The model group proctitis disease activity index value had no statistical significance before and after the treatment (P>0.05);But proctitis disease activity index value of the treatment group had statistical significance (P<0.05).The model group mice rectum mucosal epithelium necrosis falls off, clearly visible ulcers.But the histological changes of rectum was better in the treatment group mice.Conclusion the Nano Silver gel has a certain therapeutic effect on the rectal ulcer in mice, which provides a theoretical basis for the new application of Nano silver gel.

Nano Silver; Rectal Ulcer; Therapeutic Effect

杜蕊(1994-)，女，漢族，本科，研究方向為消化系統。E-mail:2816979867@qq.com

秦燕(1973-),女，漢族，碩士，副教授，研究方向為消化生理與病理。E-mail:lantingxun@126.com

R285.5

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1007-8517(2017)05-0055-03

2017-01-03 編輯：程鵬飛)