核酶阻斷IGF-1及IGF-1R表達(dá)抑制病理性瘢痕形成的研究

鄧忠遠(yuǎn)， 李孝建， 侯海靜， 張 濤

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市紅十字會(huì)醫(yī)院燒傷整形科， 廣東 廣州 510220)

核酶阻斷IGF-1及IGF-1R表達(dá)抑制病理性瘢痕形成的研究

鄧忠遠(yuǎn)， 李孝建， 侯海靜， 張 濤

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市紅十字會(huì)醫(yī)院燒傷整形科， 廣東 廣州 510220)

目的：探討胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)及其受體(IGF-1R)在瘢痕組織中的表達(dá)水平及核酶對(duì)其表達(dá)的影響作用。方法:選取2015年5月至2016年7月廣州紅十字會(huì)醫(yī)院燒傷整形科手術(shù)切除的18例患者的病理性瘢痕組織(增生瘢痕9例、瘢痕疙瘩9例)，同期收集的20例正常皮膚標(biāo)本組織，采用蘇木精-伊紅染色對(duì)組織進(jìn)行觀察，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組織標(biāo)本的IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平，取瘢痕組織成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)獲得IGF-1及其受體核酶，取第2-4代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞+核酶繼續(xù)培養(yǎng)72h后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果:正常皮膚組織、增生性瘢痕組織、瘢痕疙瘩組織中的IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間比較呈現(xiàn)正常皮膚組織<增生性瘢痕組織<瘢痕疙瘩組織的特點(diǎn)且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常皮膚組織、增生性瘢痕組織、瘢痕疙瘩組織中的IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間比較呈現(xiàn)正常皮膚組織<增生性瘢痕組織<瘢痕疙瘩組織的特點(diǎn)且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:瘢痕組織中IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平高于正常組織，核酶具有阻斷IGF-1 mRNA及其受體mRNA表達(dá)的作用，可能在抑制瘢痕的形成中發(fā)揮作用。

胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1； 瘢痕組織； 核 酶

病理性瘢痕是臨床增殖性疾病，是一種皮膚結(jié)締組織纖維化疾病，成纖維細(xì)胞增生、膠原與基質(zhì)沉積是其基本特征。臨床根據(jù)其特征分為增生性瘢痕與瘢痕疙瘩，患者會(huì)出現(xiàn)瘙癢、疼痛，病情嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)增生、攣縮、癌變等病癥[1]。相關(guān)文獻(xiàn)指出[2]，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(insulin-like growth factor -1 receptor,IGF-1R)與病理性瘢痕形成有關(guān)，是促進(jìn)瘢痕形成的重要細(xì)胞生長(zhǎng)因子。核酶是一類具有高度專一內(nèi)切核酸酶活性的RNA分子，可序列特異性地與靶RNA分子配對(duì)，對(duì)底物進(jìn)行切割，促進(jìn)mRNA的降解，降低IGF-1及其受體IGF-1R的表達(dá)。本研究分別對(duì)我院收治的9例增生瘢痕患者、9例瘢痕疙瘩患者與20例正常皮膚標(biāo)本組織實(shí)施實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IGF-1及其受體IGF-1R水平，為臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料:納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：①瘢痕的診斷標(biāo)準(zhǔn)：高出正常皮膚0.3～1.2cm、充血明顯、質(zhì)地硬、觸摸無(wú)彈性、有瘙癢感、表皮完整；②患者近三個(gè)月為接受抗瘢痕藥物治療；③正常皮膚組織來(lái)源于外傷患者手術(shù)時(shí)取材的正常皮膚組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并瘢痕破損、潰瘍、炎癥的患者；②已經(jīng)局部接受藥物、放射等方式進(jìn)行治療的患者；③瘢痕出現(xiàn)明顯萎縮的患者；④發(fā)生惡性變的患者；⑤合并嚴(yán)重的心肝腎疾病、糖尿病及結(jié)締組織疾病的患者。選取2015年5月至2016年7月廣州紅十字會(huì)醫(yī)院燒傷整形科手術(shù)切除的18例患者的病理性瘢痕組織(增生瘢痕9例、瘢痕疙瘩9例)，同期收集的20例正常皮膚標(biāo)本組織(正常皮膚)。瘢痕組織患者18例，男性12例、女性6例，年齡19～62歲，平均年齡(37.84±11.98)歲，其中增生性瘢痕患者9例，均來(lái)自于燒傷創(chuàng)面愈合后6個(gè)月的四肢及頸部增生性瘢痕；瘢痕疙瘩取自9例燒傷后患者耳垂部位的瘢痕疙瘩。正常皮膚組織20例，男性14例、女性6例，年齡23～58歲，平均年齡(39.37±9.84)歲。兩組標(biāo)本取材對(duì)象的性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有較好的均衡性。

1.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè):所有收集的增生瘢痕、瘢痕疙瘩、正常皮膚標(biāo)本組織，常規(guī)送病理切片檢查，剩余組織經(jīng)生理鹽水沖洗后，放置于含有20%胎牛血清與10%二甲基亞砜的緩沖液，經(jīng)過(guò)碾磨、碎取、孵育、沉淀、離心操作獲得DNA，于-80℃的低溫保存待檢。采用蘇木精-伊紅染色對(duì)組織進(jìn)行觀察，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)經(jīng)過(guò)引物探針設(shè)計(jì)合成、組織總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、熒光定量PCR反應(yīng)程序檢測(cè)IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平。取瘢痕組織成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)獲得IGF-1及其受體核酶，取第2-4代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞+核酶繼續(xù)培養(yǎng)72h，后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平。其試劑盒來(lái)源于日本TaKaRa公司，儀器為7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀，購(gòu)于美國(guó)ABI公司。

1.3 觀察指標(biāo):采用蘇木精-伊紅染色對(duì)組織進(jìn)行觀察，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組織標(biāo)本的IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平，培養(yǎng)72h后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 蘇木精-伊紅染色結(jié)果:取正常皮膚組織及瘢痕皮膚組織，經(jīng)蘇木精-伊紅染色在40倍顯微鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)正常皮膚組織的纖維細(xì)胞、膠原排列疏松(圖1)；瘢痕組織可見(jiàn)膠原排列緊密且雜亂、呈旋渦狀(圖2)。

2.2 不同標(biāo)本組織中IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平差異:正常皮膚組織、增生性瘢痕組織、瘢痕疙瘩組織中的IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間比較呈現(xiàn)正常皮膚組織<增生性瘢痕組織<瘢痕疙瘩組織的特點(diǎn)且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);見(jiàn)表1。

表1 不同標(biāo)本組織中IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平差異(±s,OD值)

注：*與正常皮膚比較P<0.05，#與增生性瘢痕組織比較P<0.05

圖1

圖2

圖3 不同標(biāo)本組織中IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平

圖4 培養(yǎng)72h后IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平

表2 瘢痕組織培養(yǎng)72h后IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平差異(±s,OD值)

注：*與正常皮膚比較P<0.05，#與增生性瘢痕組織比較P<0.05

2.3 瘢痕組織加核酶培養(yǎng)72h后IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平差異:瘢痕組織添加核酶培養(yǎng)72h后，正常皮膚組織、增生性瘢痕組織、瘢痕疙瘩組織中的IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間比較呈現(xiàn)正常皮膚組織<增生性瘢痕組織<瘢痕疙瘩組織的特點(diǎn)且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.4 瘢痕組織加核酶培養(yǎng)72h后與培養(yǎng)前IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平差異:增生性瘢痕組織、瘢痕疙瘩組織中的IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平較培養(yǎng)前均降低且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 瘢痕組織培養(yǎng)前后IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平差異(±s,OD值)

3 討 論

瘢痕是患者機(jī)體遭受創(chuàng)傷后細(xì)胞增殖的產(chǎn)物，纖維細(xì)胞過(guò)度增生、膠原與基質(zhì)過(guò)度沉積則會(huì)形成病理性瘢痕，在病理角度上將其分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩[4]。前者是指患者皮膚創(chuàng)傷后，在愈合過(guò)程中纖維結(jié)締組織增生異常的增值性瘢痕組織，大量成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)中膠原與蛋白多糖的過(guò)度沉積是其組織學(xué)特征。該病變位置可位于全身任意部位，過(guò)量的膠原沉積突出皮膚，但不侵入正常皮膚組織[5]。瘢痕疙瘩是一種良性皮膚腫瘤，其組織學(xué)特征與前者相似，但腫塊會(huì)超出原損傷部位，并持續(xù)生長(zhǎng)，常發(fā)于患者的前胸、肩膀、耳垂部位[6]。目前臨床治療瘢痕的方法有藥物、手術(shù)、物理康復(fù)療法等多種措施，但治療后存在瘢痕復(fù)發(fā)、療效不確切等特征，其原因?yàn)轳：郯l(fā)病機(jī)制尚未明確[7]。相關(guān)文獻(xiàn)指出[8]，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體-1R(IGF-1R)與病理性瘢痕形成有關(guān)，是促進(jìn)瘢痕形成的重要細(xì)胞生長(zhǎng)因子。故此，本研究使用分子生物學(xué)技術(shù)在基因水平阻斷IGF-1 及IGF-1R 的表達(dá)，抑制瘢痕的過(guò)度增生，為病理性瘢痕的防治提供一種新的途徑。

胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors,簡(jiǎn)稱IGFs)是一中具有促進(jìn)細(xì)胞分化、分裂及機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育等多種生物功能的細(xì)胞因子家族，IGF-ⅠIGF-Ⅱ是其重要的成員，屬于多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切聯(lián)系。IGF-I為多肽類生長(zhǎng)因子，在諸多組織細(xì)胞的增殖分裂和分化過(guò)程中發(fā)揮明顯的促進(jìn)作用，且調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。IGF-I在機(jī)體血清和組織中濃度過(guò)高時(shí)會(huì)促使正常細(xì)胞活性的改變，表現(xiàn)為失控性增殖分裂、缺乏分化且細(xì)胞死亡明顯減少，最終形成病變，出現(xiàn)瘢痕。 IGF-Ⅱ是一種酸性較弱的單鏈多態(tài)，由IGF-I編碼，由腫瘤自身組織分泌，無(wú)論體內(nèi)外它對(duì)細(xì)胞分裂、增殖的促進(jìn)作用都十分強(qiáng)效，明顯強(qiáng)于IFG-I。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中離不開(kāi)IGF-Ⅱ的生物學(xué)作用。另外，IGF-Ⅱ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用，并在內(nèi)皮細(xì)胞化學(xué)趨化過(guò)程中發(fā)生重要作用。本研究中，正常皮膚組織、增生性瘢痕組織、瘢痕疙瘩組織中的IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平具有較大差異性，組間比較呈現(xiàn)正常皮膚組織<增生性瘢痕組織<瘢痕疙瘩組織的特點(diǎn)。這表明了，IGF-1及其受體IGF-1R在瘢痕組織中具有較高的表達(dá)，參與了瘢痕組織病理性病變，其濃度水平升高是瘢痕病變的危險(xiǎn)信號(hào)，且與瘢痕病情具有正相關(guān)性。

核酶是一類具有酶活性的RNA分子，能夠催化磷酸二酯鍵水解與形成。在腫瘤治療方面，核酶具有裂解癌基因作用，針對(duì)腫瘤基因設(shè)計(jì)特異性核酶，并將其引入細(xì)胞，阻斷其基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，抑制病原增殖與腫瘤擴(kuò)散。核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊，在切斷mRNA后，能夠從雜交鏈上解脫下來(lái)重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。本研究還發(fā)現(xiàn)，瘢痕組織添加核酶培養(yǎng)72h后，組間IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平為，正常皮膚組織<增生性瘢痕組織<瘢痕疙瘩組織。這提示了，核酶能夠有效抑制IGF-1 mRNA及其受體mRNA的表達(dá)水平，阻礙瘢痕成纖維細(xì)胞增殖。因此，我們認(rèn)為，臨床應(yīng)用針對(duì)IGF-1和IGF-1R基因的核酶降低病理性瘢痕增生過(guò)程中的過(guò)分表達(dá)IGF-1和IGF-1R或阻斷IGF-1和IGF-1R生物學(xué)作用，能夠抑制瘢痕的形成，不影響愈合，且利于預(yù)防與治療瘢痕增生。

[1] 席文群,成洪波,張國(guó)明,等.慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在濾過(guò)術(shù)后抗瘢痕的研究[J].眼科新進(jìn)展,2013,33(5):489～492.

[2] 粱茶,朱斌,唐冰,等.胰島素樣生長(zhǎng)因子1在病理性瘢痕中的表達(dá)[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2012,50(21):24～25.

[3] 劉愛(ài)東,王玥,龐久玲,等.基質(zhì)金屬蛋白酶7和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在病理性瘢痕中的表達(dá):與正常瘢痕及正常皮膚組織比較[J].中國(guó)組織工程研究,2012,16(7):1165～1168.

[4] 劉杜鵑,張可佳,丁玉紅,等.病理性瘢痕綜合治療的研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2013,33(7):1731～1733.

[5] 胡成久,郭瑞珍,王燕.皮膚病理性瘢痕和瘢痕癌中Ras基因家族12/13位密碼子突變的檢測(cè)[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(4):576～578.

[6] 付晉鳳,譚加.病理性瘢痕的發(fā)生機(jī)制與修復(fù)[J].中華損傷與修復(fù)雜志(電子版),2013,8(4):6～12.

[7] Saber H, Himali J J, Beiser A, et al. 【Abstract】 T P130: High Serum Insulin-Like Growth Factor 1 is Associated with Lower Risk of Ischemic Stroke: The Framingham Heart Study[J].Stroke, 2015, 46(1):～130.

[8] 蔡浩, 唐冰,朱家源,等.病理性瘢痕中胰島素樣生長(zhǎng)因子1及受體mRNA的表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究,2012,16(46):8629～8635.

Effect of Ribozyme on Blockade of IGF-1 and IGF-1R Expression as Well as Inhibition of Scar Formation

DENGZhongyuan,LIXiaojian,HOUHaijing,etal

(GuangzhouRedCrossHospitalAffiliatedtoJinanUniversity,GuangdongGuangzhou510220,China)

Objective: To discuss insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1) and its receptor (IGF-1R) expression in scar tissue and the effect of ribozyme on the expression level. Methods: 18 cases of Pathological scar tissue from operation excision (9 cases of scar keloid, 9 cases of scar hyperplasia ) were selected in Department of Burn and Plastics, Guangzhou Red Cross Hospital from 2015 May to 2016 July, meanwhile 20 cases of normal skin tissue specimens were collected. The expression level of tissue was observed by using hematoxylin eosin staining, the expression level of IGF-1 mRNA in each tissue specimen and its receptor mRNA were detected by using real-time fluorescence quantitative PCR, scar tissue fibroblasts were derived to culture cells to obtained IGF-1 and its receptor ribozyme, the cells in the logarithmic growth phase with good growth state in 2-4 generation + ribozyme were selected to culture,72h later, the expression level of IGF-1 mRNA and its receptor mRNA were detected by using real-time fluorescence quantitative PCR. Results: The differences were statistically significant in the expression level of IGF-1 mRNA in normal skin, hypertrophic scar and keloid tissue and its receptor mRNA (P <0.05), the comparison between groups showed that normal skin hypertrophic scar tissue < hypertrophic scar tissue < scar keloid tissue and the differences were statistically significant (P <0.05).Conclusion: The expression level of IGF-1 mRNA in scar tissue and its receptor mRNA are significantly higher than those in normal tissues, ribozyme has the effect on blockade of IGF-1 mRNA and its receptor mRNA expression, which may play a role in inhibiting scar formation.

Insulin like growth factor receptor 1; Scar; Ribozyme

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目,(編號(hào)：A2015069)

1006-6233(2017)02-0228-05

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.02.016