不同原料厭氧發酵及其微生物種群的分析

黃斐

（許昌職業技術學院，河南許昌461000）

不同原料厭氧發酵及其微生物種群的分析

黃斐

（許昌職業技術學院，河南許昌461000）

文章從生物質能源制備的厭氧發酵原理出發，依據厭氧發酵的原理，對豬糞、雞糞、牛糞及秸稈為原料進行實驗，利用DGGE法進行微生物種群結構差異分析，有利于為不同原料制取生物質能源，提高能源產出效率提供科學依據。

厭氧發酵；微生物種群；生物多樣性

我國每年產生超過8億噸的秸稈和38億噸以上的禽畜糞污，大量的廢棄物閑置堆積甚至焚燒，造成環境生物污染，危害人畜健康。利用厭氧發酵原理制取生物質能源沼氣將解決這一問題。

1 厭氧發酵的原理

厭氧發酵的過程分為四個階段：①水解階段。秸稈、糞便屬于有機大分子碳水化合物，難以直接被微生物吸收利用。需要通過微生物分泌胞外酶將大分子水解為溶于水的小分子化合物；②發酵階段。有機化合物作為電子受體和供體進行生物降解的過程就是發酵。水解后，小分子化合物被發酵類細菌吸收后形成包括揮發性脂肪酸在內的末端產物后,一部分被細菌自身利用，另一部分繼續分解轉化；③產氫產乙酸階段。未被發酵類細菌利用末端產物在專性厭氧產氫細菌的作用下，進一步轉化生成乙酸類、二氧化碳和氫氣；④甲烷化階段。在分解類產甲烷菌的作用下，將乙酸進行分解，生成二氧化碳和甲烷。另一部分氧化類產甲烷菌對分解產生的二氧化碳進行氧化還原生成甲烷。

2 不同原料厭氧發酵微生物種群的分析

2.1 實驗準備

選取本地水稻秸稈，按照厭氧發酵的制備標準進行粉碎備用。分別在禽畜養殖場選取新鮮的雞糞、牛糞、豬糞，去除雜質放置在實驗用冷藏柜進行保存備用。預先培養含有沼氣細菌的培養物作為接種物，以提升沼氣發酵的啟動速度。按照實驗原料進行分組，選用CSTR(有效容積5L)在保持溫度為35℃±0.5℃的條件下保持總固體濃度為6%，水力停留30天。每日根據物料的性質、結合有機負荷率，在相同時刻按總進料150g，分別控制四組進料量。進料前后分別攪拌20min,并測定甲烷的產量及濃度，在發酵的第3、9、21、27d分別取樣于-20℃實驗用冷凍柜保存。

2.2 分析方法

DNA采用MP bio土壤基因組DNA提取試劑盒進行提取，根據微量紫外可見分光光度計測量DNA的濃度和純度。保持蛋白質純度比A260/A280在1.9±0.1時，繼續進行PCR擴增、變性梯度凝膠電泳實驗。選擇對應細菌V3區域和古菌區域選擇518R/341F/109F作為引物。在518R的5’端增加GC夾，用以提升DGGE的分辨效果。通過DGGE后得到的指紋圖譜,每一個條帶代表某個微生物優勢菌群,經測序和序列比對,從而得出此優勢菌群的種類。

2.3 實驗結果及分析

（1）甲烷產量及甲烷濃度。四種原料的甲烷產量以豬糞的產量最高，牛糞最低。牛糞、豬糞、雞糞、秸稈的甲烷產量最高峰分別出現在第1、23、24、28天。牛糞的甲烷產量低的主要原因可能與飼養過程中牛服用抗生素有關。而秸稈則是含有大量纖維素、木質素,延緩講解速度，使得厭氧發酵在第一階段水解產生限速，進而延緩了整個厭氧發酵周期。當甲烷濃度達到50%及以上時，甲烷化反應占據明顯優勢。濃度與產量相同，表現出豬糞最高、牛糞最低，濃度與產量基本呈一致變化。

（2）細菌、古菌的DGGE分析。細菌DGGE分析：厭氧發酵初期細菌各微生物的群落比較穩定，實驗進行過半時，生物菌群發生了明顯的變化，新增了多條條帶，前15天表現的優勢條帶逐漸弱化，顏色變淺。豬糞的圖譜在整個過程中表現出穩定的特性，而牛糞的條帶從數目、顏色深淺方面均呈弱勢。選取11個條帶進行切膠克隆，并完成測序和對比。發現含有大量不可培養的細菌種類，如梭菌屬、抑桿菌屬等，所列的兩類菌群在厭氧發酵的第三階段發揮了重要作用，在秸稈的發酵過程中，厚壁菌門、變形菌門與擬桿菌門為優勢種群。根據Shannon-Wiener指數(H)判斷細菌菌群的多樣性指數，雞糞細菌多樣性指數最高，保持在3.59～3.73。

古菌菌DGGE分析：厭氧發酵的初期，古菌各微生物厭氧發酵群落變化中，雞糞的周期相似性差異比較明顯，豬糞則結構相似。牛糞的各菌群聚在不同分支上，處于不斷調整的過程中。選擇其中6條條帶進行切膠克隆，并完成測序和對比。發現含有包括古菌甲烷鬃菌屬、甲烷八疊球菌屬等不可培養古菌群。甲烷八疊球菌屬屬于優勢微生物，產生大量的甲烷氣體。判斷古菌菌群的多樣性指數，雞糞古菌多樣性指數最高，可達3.55。

3 結語

對不同原料厭氧發酵所產出的甲烷產量、濃度以及微生物種群多樣性進行分析，有利于對甲烷生產進行優化，調整產氣效率。根據文章所設計實驗，可以看出在甲烷產氣的過程中，以雞糞的菌群多樣性最佳，但是豬糞的菌群發展比較穩定，產氣數量及濃度最高。

［1］杜婷婷,云斯寧,朱江,等.生物質廢棄物厭氧發酵的研究進展［J］.中國沼氣，2016，34（2）：46-52.

［2］李海紅，巴琦玥，閆志英，等.不同原料厭氧發酵及其微生物種群的研究［J］.中國環境科學，2015，35（5）：1449-1457.

黃斐（1983-），男，河南許昌人，大學本科，助教，主要研究方向：微生物、發酵食品。