超聲造影在腫瘤化療模型中診斷價值的初步探索

周世崇，常 才，樂 堅，范亦武，陳 敏

復旦大學附屬腫瘤醫院超聲診斷科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

目前，國內女性惡性腫瘤中乳腺癌發病率居第1位[1]。新輔助化療在其治療中應用日益廣泛[2]，但療效評估仍依賴最終病理分級。現有影像學技術可監測腫瘤在化療前后的大小變化，但無法在化療早期預測最終療效[3-4]。現有研究顯示，腫瘤可促進大量新生血管產生，這是其生長、侵襲和轉移的基礎[5]。超聲造影劑具有純血池灌注特性，本研究擬通過超聲造影觀察化療前后腫瘤血供改變，以達到早期預測化療療效的目的。

1 資料和方法

1.1 研究對象

實驗動物為無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級BALB/c裸鼠，雌性，4周齡。人乳腺癌細胞株MCF-7來自復旦大學附屬腫瘤醫院中心實驗室。取對數生長期細胞，制成密度約為2×107/mL的細胞懸液。于每只裸鼠右側胸壁乳墊下注射接種0.3 mL細胞懸液，誘導裸鼠產生乳腺癌。接種后連續觀察1周，以接種部位皮下出現腫瘤結節、質地較硬等指標認為成瘤。4周后，瘤體長至直徑約2.0 cm時進一步實驗。

將荷瘤裸鼠按完全隨機法分成實驗組和對照組，每組30只。每組再按給藥時間點分成3個亞組，每個亞組10只。化療前組：不給藥，第1天給藥前處死。化療1次組：第1天給藥，第7天第2次給藥前處死。化療2次組：第1、7天貫序給藥，第14天處死。各亞組小鼠于處死前稱量體質量，測量腫瘤長徑及短徑，腫瘤體積換算公式=長徑×短徑2/2。

1.2 化療方案

實驗組給藥方案C M F：環磷酰胺(cyclophosphamide，C)+甲氨蝶呤(methotrexate，M)+氟尿嘧啶(fluorouracil，F)。給藥劑量嚴格依據Lloyd等的實驗設計[6]，單藥劑量為2/3 LD10。各藥LD10劑量具體如下[7-9]：環磷酰胺100 mg/kg，甲氨蝶呤27 mg/kg，氟尿嘧啶140 mg/kg。模擬臨床給藥方案CMF。在實驗組亞組給藥的同時，相應對照組亞組給予生理鹽水，均為腹腔注射。

1.3 儀器與方法

全部實驗動物于處死前進行超聲造影檢查。使用意大利Esaote公司MyLab90多普勒彩色超聲診斷儀，探頭頻率8～12 MHz。超聲造影劑為意大利Bracco公司SonoVue，每只裸鼠通過尾靜脈注射0.005 mL。注射后立即進行造影觀察，記錄數據。造影結束后于探頭下置入定位針，確定觀察區域。采用德國TomTec公司分析軟件SonoLiver脫機分析造影數據，獲取以下造影參數：腫瘤灌注峰值強度(maximum intensity，IMAX)，即造影劑灌注達峰時對比對照區域的強度值；上升時間(rising time，RT)，即灌注從峰值10%至90%強度所需時間；灌注達峰時間(time to peak，TTP)，即從開始灌注至達峰所需時間；平均渡越時間(mean transit time，mTT)，即病灶峰值強度下降一半所需時間。

全部裸鼠于置入定位針后脫頸處死，沿探頭方向剖開瘤體，取定位針所在厚度約5 mm、長度包含全部造影瘤體的組織，固定后石蠟包埋切片。檢測微血管密度(microvascular density，MVD)，血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)-1/2/3。將實驗組中化療前亞組和2次化療亞組的腫瘤標本切片，于光學高倍鏡下進行腫瘤細胞計數。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 腫瘤物理指標

腫瘤生物指標包括荷瘤裸鼠體質量、腫瘤體積(表1)。第1次給藥后：體質量組間對照(P=0.000)和組內對照(P=0.000)差異均有統計學意義；腫瘤體積組間對照(P=0.000)差異有統計學意義，組內對照(P=0.539)差異無統計學意義。第2次給藥后：體質量組間對照(P=0.000)和組內對照(P=0.000)差異均有統計學意義；腫瘤體積組間對照(P=0.000)差異有統計學意義，組內對照(P=0.46)差異無統計學意義。

2.2 腫瘤微循環指標

微循環指標包括MVD、VEGFR-1/2/3(表2)。第1次給藥后：MVD組間對照(P=0.138)和VEGFR-3組間對照(P=0.069)差異無統計學意義，組內對照(P=0.205)差異無統計學意義；VEGFR-1組間對照(P=0.008)顯著下降，VEGFR-1組內對照(P=0.007)顯著下降。第2次給藥后：MVD組間對照(P=0.000)和VEGFR-3組間對照(P=0.003)顯著下降，MVD組內對照(P=0.004)顯著下降；VEGFR-1組間對照(P=0.000)顯著下降，VEGFR-1組內對照(P=0.000)顯著下降。鏡下切片見圖1～2。

2.3 超聲造影指標

超聲造影指標包括IMAX、RT、TTP和mTT(表3)。第1次給藥后：IMAX組間對照(P=0.001)和組內對照(P=0.000)顯著下降；TTP組間對照(P=0.427)和組內對照(P=0.376)差異無統計學意義。第2次給藥后：IMAX組間對照(P=0.000)和組內對照(P=0.000)顯著下降；TTP組間對照(P=0.001)和組內對照(P=0.001)顯著上升。超聲造影見圖3～5。

表 1 腫瘤生物指標

2.4 病理結果

在光學顯微鏡40倍物鏡下計數，化療前實驗組腫瘤細胞密度為464.92±60.85/HF，2次化療后實驗組腫瘤細胞密度為136.99±17.3/HF，化療后腫瘤細胞顯著減少(P=0.000)。

表 2 腫瘤微循環指標

表 3 超聲造影參數

圖 1 實驗組化療前、化療1次、化療2次的MVD鏡下切片

圖 2 實驗組化療前、化療1次、化療2次的VEGFR-1鏡下切片

圖 3 化療前腫瘤超聲造影圖

圖 4 化療1次后的腫瘤超聲造影圖

圖 5 化療2次后的腫瘤超聲造影圖像

3 討 論

目前，超聲造影預測抗血管生成藥物療效的研究比較多。有研究報道[10-14]，在動物腫瘤模型中使用抗血管生成藥物，伴隨著腫瘤微循環指標降低，超聲造影參數出現不同程度的改變，部分研究認為超聲造影參數與抗血管療效相關。然而，臨床使用的大部分化療藥物主要通過抑制腫瘤細胞DNA和RNA合成來抑制腫瘤生長，作用機制不同于抗血管藥物。有研究報道[15-16]，超聲造影在新輔助化療前后曲線有顯著變化，但缺乏足夠的量化參數。有研究報道[17-19]，單獨使用化療藥物如順鉑或阿霉素，可觀察到腫瘤的微循環指標改變，且伴有超聲造影參數變化，但他們沒有研究早期變化與腫瘤化療療效的關系。本研究模擬臨床聯合化療方案，探討用藥后腫瘤微循環指標的改變及超聲造影指標的改變，并分析兩者的關系。

本研究中，MVD在第2次化療后的組內和組間出現顯著下降，與既往報道[17-19]吻合。進一步研究發現，VEGFR-1在首次化療后組內和組間即出現顯著下降，提示作為微循環指標，其可能比MVD對化療藥物更敏感。2次化療后，腫瘤細胞下降70%以上，按病理MP分級，屬不完全緩解中的3級。浸潤癌細胞的降低達30%～90%，屬中度減少。由此可見，腫瘤細胞被化療滅活的同時，出現了顯著微循環改變。

第2次化療后TTP在組間和組內均顯著上升，提示腫瘤滅活后灌注時間延長，很可能是微循環受到破壞所致。對比病理結果，腫瘤體積在2次化療后較化療前未出現顯著變化，而部分微循環指標和部分造影指標出現顯著變化，兩者具有一致性，均早于腫瘤物理體積的變化。

在乳腺癌新輔助化療模型中，超聲造影部分指標變化與腫瘤微循環指標變化具有一致性，均早于腫瘤物理體積變化。雖然尚未證實兩者相關，但值得進一步深入研究。

本研究存在以下不足：樣本量相對較小，無法進行相關性分析；僅模擬了一種新輔助化療方案；MCF-7細胞也不能體現乳腺癌免疫組化和基因分型的多樣性。

綜上所述，超聲造影參數IMAX和TTP在化療過程中，與腫瘤微循環指標MVD和VEGFR-1的變化具有一致性，提示超聲造影具備了預測新輔助化療療效的潛力。

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