機械生物學與創面愈合研究進展

李 巍，岑 瑛

(1.四川大學華西醫院整形燒傷科，四川 成都 610041；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院燒傷科，四川 成都 610072)

機械生物學與創面愈合研究進展

李 巍1，2，岑 瑛1

(1.四川大學華西醫院整形燒傷科，四川 成都 610041；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院燒傷科，四川 成都 610072)

細胞和組織的機械生物學的基礎和臨床研究指出機械力在皮膚再生和傷口愈合過程中的重要性。本文簡述細胞外基質剛度對細胞生理學的特殊限制，定義了何種機械變化及其如何影響組織再生和傷口愈合，機械信號在細胞增殖、分化和皮膚再生過程中的影響，旨在說明機械生物學在皮膚損傷修復和傷口愈合中的作用機制。

機械生物學；創面愈合

人體皮膚是一種以活躍的方式對影響其的物理力量作出反應的器官，它是一種多方面的生物系統，具有獨特的塑性和再生能力。機械生物學的研究促進了使用支持創面愈合的機械力新療法的發展。更好地理解生物力學將能更好的開發具有適當的物理和化學性質的生物材料用于治療愈合不良的創面。本文通過認識機械信號在細胞增殖、分化和皮膚再生過程中的作用和機制來理解機械力變化如何影響組織再生與創面愈合。

1 創面愈合基礎

人體皮膚損傷后組織的解剖連續性的恢復和功能的重建是一個復雜的，動態的過程，在時間上協調稱為傷口愈合，分為四個連續的階段：體內平衡，炎癥，再上皮化和組織重塑。這些階段是緊密組織和精確調節的復雜的細胞，信號通路和細胞外基質(ECM)之間的相互作用[1]。

在皮膚受傷之后，血管閉合，形成纖維蛋白聚集物，釋放生長因子(如血小板衍生生長因子和表皮細胞生長因子)，與炎癥相關的細胞(單核細胞，嗜中性粒細胞)遷移到傷口中。在接下來的1～3天中表皮角化細胞遷移到表皮的傷口床再生層，簡稱為上皮化，是功能性表皮的再生和防止感染發展的關鍵。真皮成纖維細胞向傷口區移位并開始ECM組分的合成與重塑。傷口區域中的成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞，收縮拉緊傷口邊界。在這一階段，肌成纖維細胞強力增殖和合成ECM的組件，同時保持組織完整性和促進其再生[2]。在受傷區域中產生新的，健康的組織取決于細胞增殖，遷移和分化。在任何階段調節這些過程的機制出現障礙導致傷口愈合受損。受損的傷口愈合可以是緩慢的(如在糖尿病、褥瘡或暴露于輻射的情況下)或加速的(與肥大和瘢痕疙瘩相關)。在加速愈合的情況下，存在大量的ECM沉積，增加的細胞增殖和傷口血管形成。

皮膚細胞對機械力的特異性反應對于傷口在物理環境中的行為方式是至關重要的。體外研究顯示，成纖維細胞和角質形成細胞負責機械刺激，幾乎所有方面的細胞行為可能受到調制，不當的力學轉導是許多病理變化的原因，包括傷口愈合受損和瘢痕形成。

2 機械調節細胞增殖和分化

廣泛接受的穩態概念描述了對組織的結構損傷激活生物體的反應以恢復受損的皮膚機械平衡。不同病因和解剖位置的創傷具有影響其愈合方式的特定機械性質[3]。細胞接受機械刺激的信號如何傳遞到細胞中，以及這些信號如何調節基因表達和蛋白質合成是重要的問題。作為機械傳感器的細胞結構是細胞膜、機械敏感離子通道、糖萼、灶粘連、蛋白質和細胞間復合物。機械轉導的基本機制是基于將細胞結構接收的機械信號轉化為細胞間信號通路，以確定其與不同輔因子和靶基因特異性的相互作用，從而調節轉錄變化。在另一個模型中，細胞本身被認為是具有給定物理性質例如其粘度、彈性或剛度的區室化機械體[4]。

細胞受到其環境的機械力，例如ECM的柔軟性或剛性，附著底物的差異或由相鄰細胞施加的張力的影響。ECM的物理性質取決于結合ECM組分的整聯蛋白的微米和納米形貌。整聯蛋白是形成粘附點的蛋白質復合物的一部分。它們負責在ECM的組分(例如膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白和玻連蛋白)和肌動蛋白細胞骨架的銜接蛋白之間產生直接的物理連接。肌動蛋白絲與整聯蛋白參與的結合過程在細胞中產生張力，其同時激活調節F-肌動蛋白聚合的肌動蛋白相關蛋白。這影響肌動蛋白絲和整聯蛋白的空間組織，從而增加細胞對ECM的粘附。

而細胞微環境信號決定了干細胞的生長和分化的方向[5]：間充質干細胞(MSC)的分化方向決定于它們的幾何形狀，也取決于其直接周圍環境的剛性。當在具有骨樣剛性的合成底物上生長時，MSC分化成成骨細胞，當它們在中等剛性的底物上生長時分化為成肌細胞，在軟底物上分化成神經元和脂肪細胞。已經表明，細胞角蛋白細胞骨架對角質形成細胞的力學和力學信號轉導具有顯著影響，損傷組織中的ECM改變其化學組成和剛度，啟動修復過程。成纖維細胞接收的機械信號指導它們轉化成肌成纖維細胞[6]。肌成纖維細胞的轉化，在剛性3D膠原基質中，或在傷口肉芽化和纖維化組織期間，都必須用TGF-β1刺激。降低機械應力或降低ECM的剛性可誘導細胞凋亡并降低α-SM肌動蛋白和肌成纖維細胞收縮能力的表達。機械張力的增加和肌成纖維細胞的收縮都可以通過增加它們的收縮能力和它們的ECM組分的合成活性來激活細胞。另一方面，參與TGF-β1潛在形式活化的阻斷整聯蛋白(αvβ5、α3β1、α11β1和αvβ1)是調節肌成纖維細胞在傷口愈合過程中的活性的替代途徑[7]。

集體的、協調的細胞遷移是傷口愈合機制的重要部分，類似于胚胎發育[8]和腫瘤細胞的入侵。與其他上皮相比，角質形成細胞產生特別強的細胞間連接，使得即使在具有很少或高度分散的ECM底物用于特定整合素受體的環境中也發生集體遷移[9]。細胞之間的連接可以促進傷口上皮化，同時對ECM具有有限的或變化的粘附，并且在缺少特異性整聯蛋白的情況下促進傷口閉合。因此，描述緩慢或加速的傷口愈合中涉及的精確機制的關鍵研究領域是研究特異性整聯蛋白，細胞骨架的組分和參與力學轉導的靶蛋白的表達，以及進行徹底分析機械傷口環境[10]。

在細胞動力學的體外模型中，證明空間限制的消除導致細胞快速移動到S期，其過程取決于臨界尺寸，形狀以及指示細胞在其環境中的空間限制的機械信號的接收。這種機制與構成組織的單個細胞和細胞群有關，并且其導致停止細胞擁擠，從組織排除和凋亡[11]。當肌動蛋白的張力下降時，該機制被激活。細胞骨架張力的程度是確定細胞的空間大小的機械信號，并且可以通過調節細胞增殖的途徑進行進一步轉導，例如是相關蛋白(YAP)，S相激酶相關蛋白2(SKT2)或細胞外信號調節激酶(ERK)[12]。細胞骨架的動力學隨細胞的機械環境變化而變化，在短時間內(比平均細胞周期時間更快)延伸。因此，開放空間可以增加細胞增殖，但是信號的短持續時間可以限制增殖的過度調節。該系統的功能已經在與發育和器官生長以及與異常增殖相關的病理過程中得到證明。這種機制可以在傷口愈合期間細胞再生和調節細胞增殖的模型中觀察到。細胞不需要記錄與傷口尺寸相關的信息，它們只侵入在該特定時刻可用的空間。降低細胞的機械張力激活增殖和遷移的過程，另外的細胞分裂填充開放空間，填充滿后細胞回縮到它們在非活動狀態下所具有的大小，其進一步分裂被抑制。總之，在發育、再生和癌細胞侵襲的過程中，G1-S期邊界上的細胞周期的進展可以通過接受細胞環境的空間限制的機械敏感控制點來調節[13]。

理解力學傳遞的過程還需要研究什么樣的機械力傳遞到細胞核。有證據表明，細胞骨架的直接機械耦合，加上核包膜和核心骨架中的變化，可以是調節基因表達的替代或另外的方式[14]。已有的觀察證明，機械細胞刺激通過拉伸或壓縮影響核的形狀和核質結構的組織[15]。傳遞的機械力同時也影響基因表達，核蛋白接收和參與機械信號的轉導，并與調節核心蛋白的活性的生物化學信號化結合[16]。

3 機械力量調節的轉錄因子

3.1 轉錄共激活因子YAP和TAZ YAP及其同源物TAZ(具有轉錄共激活因子與PDZ結合基序的轉錄共激活因子)是Hippo信號傳導途徑的關鍵效應物。在正常皮膚中，YAP位于表皮基底層和毛囊上皮的角質形成細胞的細胞核中。在愈合傷口中，YAP高度表達在愈合組織的整個區域內。YAP定位的地形學表明在愈合的皮膚中存在參與YAP易位至細胞核的信號的激活，最可能作為抑制Hippo通路的作用。對YAP定位偏移的另一種解釋可能是組織損失和細胞區域機械環境變化的事實，這也可能激活YAP[17]。TAZ在正常組織中的免疫細胞化學定位顯示其主要存在于成纖維細胞的細胞質中。在強烈的傷口愈合期間，大多數細胞中，TAZ從細胞質重新定位到細胞核。此外，TAZ的表達在經歷強烈再生的組織區域更強。

它們的活性在磷酸化的途徑上被Hippo途徑的主要激酶LATS 1/2抑制。YAP和TAZ通過與屬于TEAD家族(TEA結構域家族成員)的轉錄因子的相互作用激活基因轉錄。由YAP/ TAZ誘導的基因參與細胞增殖、凋亡避免、干細胞擴增、器官大小控制及組織再生的調節[18]。

YAP/TAZ轉錄共激活因子除了參與Hippo通路的信號傳遞之外，還與其它蛋白質相互作用并響應細胞的機械刺激。許多與YAP和TAZ分子結合的蛋白質具有結合肌動蛋白的能力，并且可以調節細胞骨架結構的變化，或受其調節[19]。

3.2 YAP和TAZ在皮膚穩態和傷口愈合中的作用 表皮的分層過程可以解釋為由細胞-ECM接觸的喪失誘導的細胞分化。YAP在表皮中的位置和活化似乎也依賴于細胞-ECM的相互作用。在表皮層的增殖細胞中，YAP定位在細胞核中，并且上層的分化細胞存在于細胞質中。核中YAP的增加增殖并抑制細胞分化。相比之下，YAP的失活導致增殖和早熟分化的抑制[20]。

表皮的體內平衡還取決于細胞-細胞接觸。表皮中α-連環蛋白表達的降低導致YAP活性的增加；然而這種依賴性對于基底層細胞特別有限。在需要保持YAP活性的正確細胞-細胞接觸的情況下，其它信號的存在是必要的，其可以包括響應于機械信號的細胞骨架動力學的移動。

在體內和體外的許多研究中，已經顯示了YAP和TAZ表達和傷口愈合和組織再生的過程之間的關鍵依賴性。YAP和TAZ的核定位對組織再生能力和在傷口愈合期間對外部信號的反饋具有主要影響。在傷口愈合期間，向核的易位和YAP/ TAZ活化具有以傷口閉合，細胞增殖和膠原合成為特征的強的多效性作用[21]。YAP/TAZ的受傷抑制皮膚傷口愈合，這表明這些因素在組織再生中的重要作用。基于YAP/TAZ作為皮膚其他細胞類型的力學轉導調節劑的多種功能，可能這種信號通路也介導表皮機械傳感。

這些觀察表明YAP/ TAZ通過動員TGF-β1的合成和激活參與創傷愈合的調節，并且與TGF-β1相關的信號誘導諸如SMAD和CTGF的因子的活性。結合信號通路YAP/TAZ與TGF-β1/SMAD是調節傷口愈合的多階段過程的重要因素。

3.3 血清反應因子(SRF) SRF是在用血清處理的成纖維細胞中發現的轉錄因子。細胞突然暴露于血清作為表示損傷和組織損傷的信號，因此，它們開始愈合過程。血清暴露不僅導致有絲分裂激活，它是一個更復雜的過程，涉及對上皮和內皮細胞及成纖維細胞的影響[22]。

SRF負責調節增殖和細胞分化的基因的表達。SRF被促有絲分裂蛋白激酶或Rho-A通路激活，并通過調節因子，信號蛋白和細胞骨架組分產生快速轉錄反應。存在約300個由SRF應答元件組成的已知基因；其中，存在早期細胞反應的基因(例如c-FOS，cyr61)，其在傷口愈合過程中的表達是重要的。SRF是誘導傷口愈合過程中成纖維細胞分化的關鍵因素。SRF在干細胞，上皮細胞以及成纖維細胞中的過表達促進其向肌成纖維細胞的轉化。

SRF的活性可以通過許多獨立的途徑來調節。在松弛的平滑肌細胞中，已經顯示SMAD-7(TGF-β信號轉導的抑制劑)與SRF的活性的關系。TGF-β水平的增加削弱了這種相互作用。已經表明，整聯蛋白連接激酶(ILK)的激活和SRF磷酸化與TGF-β1信號傳導相關。此外，絲氨酸-103處的磷酸化促進了與ILK活性成比例地將SRF與平滑肌的β-肌動蛋白連接的能力，并且還提高了蛋白質的穩定性。已經證明影響SRF活性的因素之一是細胞骨架的動力學和輔因子G-肌動蛋白MAL(巨核細胞白血病1)的活性。

3.4 S期激酶相關蛋白2(SKP2) SKP2蛋白第一次被確定為周期蛋白A-CDK激酶/S期復合物的重要元素。在進一步的研究中，它被描述為結合到SKP1的蛋白質，其與其組成連接酶泛素型SCF復合物(Skp1-cullin-F盒)，其通過依賴于泛素的蛋白水解參與細胞周期的調節。SKP2是SCF復合物的識別亞基，底物是p27蛋白。泛素化和p27的蛋白酶體降解使轉換的S期細胞周期和促進細胞增殖[23]。

SKP2表達和增殖的促進是生長因子的信號轉導和影響細胞的機械力之間協作的結果。在對平滑肌和成纖維細胞進行的研究中，顯示生長因子在蛋白質穩定水平上調節SKP2的水平；相反，細胞的機械張力的增加導致蛋白質表達在轉錄水平上的增加。細胞對基質的粘附和細胞的機械張力是保持SKP2轉錄的條件。

SKP2啟動子的活化取決于轉錄因子NFAT1(活化T細胞的核因子)的結合。NFAT1屬于由細胞質中的鈣離子水平激活的四種轉錄因子家族。鈣離子通過依賴鈣調素的機制激活鈣調神經磷酸酶的磷酸酶。NFAT中絲氨酸的去磷酸化誘導構象變化，其暴露核定位信號(NLS)并覆蓋核輸出信號(NES)。NFAT1的完全去磷酸化導致構象變化，其激活蛋白質功能如轉移到核，與DNA結合和轉錄激活。

4 發展前景和臨床意義

細胞和組織力學生物學和臨床基本研究更重要的問題是哪些分子在特定的通路相互作用響應機械力，如何控制目標基因活動，何種機械感覺擾亂皮膚再生和傷口愈合。這些研究的結果將有助于開發新的治療。

在美容醫學中使用A型肉毒桿菌毒素相關的觀察指出在使用肉毒桿菌毒素的區域中瘢痕形成的減少，這些效應歸因于在其重塑期間減少的傷口張力，從而減少肥大性瘢痕的形成[24]。

使用負壓真空輔助閉合技術(NPWT)是支持各種慢性傷口的快速愈合的有效方法[25]。另一種有益的治療方法是體外沖擊波治療(ESWT)[26]，被認為是軟組織傷口的有效物理模式，并且可能誘導機械傳導和免疫調節的機制，完成的傷口閉合和上皮化。這些技術的機制基于力學傳導，研究結果和臨床醫生的意見顯示了在傷口愈合和瘢痕形成過程中機械力轉導的重要性，進一步的研究集中于評估最佳治療參數和使用支持治療的附加材料。在不久的將來，力學生物學與生物材料和納米技術的科學對異常細胞信號負責增殖，分化、細胞死亡和恢復生物平衡進行的精確干擾。

此外，機械信號轉導機制的知識及其參與某些基因的激活開辟了使用機械和藥物治療的組合療法的新途徑。在傷口愈合和瘢痕形成中重要性的增加將有助于設計新的臨床治療和外科手術，提高治療的有效性。

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Research progress of mechanobiology and wound healing

LI Wei，CEN Ying

R622

B

1672-6170(2017)03-0131-04

2017-01-23；

2017-03-24)