循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展

謝升龍，薛 洋，叢 偉，△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胸外科，四川 成都 610000)

*通訊作者

循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展

謝升龍1，薛 洋2，叢 偉1，2△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胸外科，四川 成都 610000)

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，傳統(tǒng)的診斷方法主要有病理組織學(xué)檢查、影像學(xué)方法和腫瘤標(biāo)志物檢測。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)檢測可用于實(shí)時(shí)、無創(chuàng)地進(jìn)行組織學(xué)鑒定，可能成為肺癌早期診斷、復(fù)發(fā)檢測、療效評估的一個(gè)重要手段。以下對肺癌中循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)進(jìn)行綜述。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞；肺癌；早期診斷；復(fù)發(fā)監(jiān)測；療效評估

支氣管肺癌(簡稱肺癌)是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年死亡人數(shù)達(dá)140萬，占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的80%[1]。2011年中國惡性腫瘤發(fā)病率第1位是肺癌，每年新發(fā)病例約65萬，惡性腫瘤死亡率第1位也是肺癌，每年死亡病例約52萬[2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌80%以上，由于肺癌早期診斷方法的限制，我國約75%的肺癌患者在診斷時(shí)已屬晚期，5年生存率約為15.6%，而早期肺癌5年生存率能達(dá)到66.7%[3]。因此，肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療顯得尤為重要。目前，臨床上對于肺癌的診斷、監(jiān)測、療效評估主要依賴于病理組織學(xué)檢查、影像學(xué)方法和腫瘤標(biāo)志物檢測，難以在早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，也無法在早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)以及治療效果的評估。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)指來源于實(shí)體瘤的腫瘤細(xì)胞，在不斷增殖過程中具有侵襲性，細(xì)胞脫離腫瘤組織通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，成為具有侵襲轉(zhuǎn)移能力的CTCs。血液中出現(xiàn)CTCs是腫瘤可能發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的信號，CTCs檢測可比影像學(xué)檢查、病理組織學(xué)檢查、血清腫瘤標(biāo)志物檢測更早發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，是一種簡便易行、可重復(fù)操作、微創(chuàng)的新型檢測手段。

1 肺癌CTCs概述

CTCs是1869年由澳大利亞內(nèi)科醫(yī)生Thomas Ashworth首次通過顯微鏡在一名死于轉(zhuǎn)移瘤患者體內(nèi)的外周血中發(fā)現(xiàn)的，這種在外周循環(huán)中存在的與原發(fā)腫瘤類似的細(xì)胞稱為CTCs[4]。由于受限于當(dāng)時(shí)的科學(xué)技術(shù)和醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這種在外周血中發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞并沒有被醫(yī)學(xué)界充分重視。直到本世紀(jì)初，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過使用先進(jìn)的醫(yī)學(xué)設(shè)備才得以發(fā)現(xiàn)CTCs的臨床使用價(jià)值。多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)[5～7]CTCs檢測技術(shù)能在肺癌的輔助診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測、療效評估方面發(fā)揮重要的臨床價(jià)值。

在過去的幾十年里，對于NSCLC的治療，化療基礎(chǔ)之上的綜合性治療得到了飛速的發(fā)展。而肺癌驅(qū)動基因突變的發(fā)現(xiàn)，使得醫(yī)學(xué)界對于NSCLC的分類得到了重新的認(rèn)識，同時(shí)改變的還有非小細(xì)胞肺癌的治療[8]。基于表皮生長因子受體(epidermalGrowth Factor Receptor，EGFR)突變和間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)基因重組，也已成功的研發(fā)出了相對應(yīng)的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhabitors，TKIs)靶向治療藥物。基于其他驅(qū)動基因突變(如ROS、MET、RET、BRAF)也有了相對應(yīng)的治療策略。但是，涉及驅(qū)動基因突變的個(gè)體化治療的患者在整個(gè)非小細(xì)胞肺癌患者中只占到了一小部分，還有絕大部分患者依靠目前的檢測手段無法找到合適的個(gè)體化治療方案或者對現(xiàn)存的個(gè)體化治療方案耐藥。

2 CTCs的檢測方法

由于CTCs在其外周血中的數(shù)量很少，每105～107個(gè)有核細(xì)胞中才有一個(gè)CTCs[9]，因此對CTCs 的檢測技術(shù)要求更為準(zhǔn)確、敏感。CTCs的檢測方法主要分為兩部分：CTCs富集技術(shù)和CTCs檢測技術(shù)。目前，CTCs檢測方法有很多種，但是，理想的檢測方法應(yīng)該是：高度敏感、高度準(zhǔn)確、易于操作。

2.1 CTCs富集技術(shù) CTCs檢測的富集技術(shù)主要基于CTCs的生物學(xué)特性和物理學(xué)特征(如CTCs的大小、密度、帶電性、可變形性、細(xì)胞表面蛋白、生存能力和侵襲性)進(jìn)行富集。目前常見的富集方法有：①密度梯度離心法：利用商品化的分離液，將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，根據(jù)血液中各種細(xì)胞的密度不同，離心后各種細(xì)胞成分分層，從下向上依次為：紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、分離液、單個(gè)核細(xì)胞 (包括CTCs)，最上層是血漿，為防止離心前血細(xì)胞與分離液混合而不利于分離，建立了OncoQuick 方法，用一種專用的50 ml試管，在分離液與血液之間放置多孔屏障，這種方法的局限性是部分腫瘤細(xì)胞可遷移至血漿層或在離心管底部形成非特異性的聚合物而丟失 CTCs[10]。②免疫磁珠法：免疫磁珠分離技術(shù)是目前比較常用的CTCs分離和富集技術(shù)。他的原理是基于CTCs主要表達(dá)上皮源性表面標(biāo)志，利用抗原抗體方法分離和富集CTCs，具體分為陽性富集方法和陰性富集方法。前者通過磁珠偶聯(lián)上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM)和細(xì)胞角蛋白(cytokerins，CKs)等標(biāo)志直接富集外周血中上皮來源的循環(huán)細(xì)胞。后者通過磁珠偶聯(lián)CD45等白細(xì)胞標(biāo)志，去除外周血白細(xì)胞而間接富集稀有上皮細(xì)胞。目前基于免疫磁性原理富集或同時(shí)檢測CTCs的技術(shù)主要有CellSearch系統(tǒng)、免疫磁性細(xì)胞分選儀(magnetric cell sorting，MACS)，AdnaTest癌細(xì)胞檢測系統(tǒng)和萊爾系統(tǒng)等[11]。③膜過濾法：膜過濾法主要基于腫瘤細(xì)胞的尺寸一般較大的特點(diǎn)(平均直徑超過8 μm)[12]。腫瘤細(xì)胞尺寸分離 (isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)技術(shù)，主要是利用腫瘤細(xì)胞直徑一般大于正常細(xì)胞的物理特性來分離CTCs。將血液通過孔徑為8 μm的濾膜過濾，正常細(xì)胞濾過而CTCs聚集于濾膜上，從而達(dá)到富集作用。然而，外周血中單核細(xì)胞大小跨度較大，直徑可達(dá)17 μm左右。因此，此方法不僅可能會漏掉直徑較小的CTCs，更可能捕獲較大的白細(xì)胞，從而使得其靈敏性及特異性下降[13]。

2.2 CTCs檢測技術(shù) CTCs的檢測技術(shù)則是對CTCs表達(dá)的特異性組織蛋白或者mRNA進(jìn)行檢測。目前的方法有：①配體靶向PCR技術(shù)(ligand-targeted PCR method，LT- PCR)：這種檢測技術(shù)是我國首創(chuàng)的檢測技術(shù)，他的基本原理是肺癌患者的CTCs表面會過量表達(dá)某些特異性受體，如葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)R)，靶向PCR運(yùn)用的配體類似物交聯(lián)核苷酸片段作為檢測探針，通過細(xì)胞表面特異性受體與其配體類似物的結(jié)合以實(shí)現(xiàn)探針與CTCs的結(jié)合，從而將CTCs的數(shù)目轉(zhuǎn)化為探針的數(shù)目，然后通過對探針的PCR定量檢測來計(jì)算CTCs的數(shù)目。由于具有受體配體結(jié)合(1個(gè)CTCs表面存在上萬個(gè)特異性受體)及PCR的兩次信號放大，從而可使1個(gè)CTC信號放大約1012倍。因此，配體介導(dǎo)的靶向PCR法，具有超高的靈敏度的特點(diǎn)，從而使早期肺癌中探測CTCs成為了可能[14]。②逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(reverse- transcriptase PCR，RT-PCR)：RT-PCR檢測技術(shù)是通過檢測上皮源性腫瘤細(xì)胞的mRNA以達(dá)到對CTCs檢測的目的。這種技術(shù)能夠?qū)⒀h(huán)中數(shù)量極低的mRNA通過聚合酶鏈反應(yīng)，使檢測底物數(shù)量呈指數(shù)增長，再進(jìn)行檢測，具有靈敏度高，價(jià)格低廉的特點(diǎn)，是目前檢測腫瘤隱匿微轉(zhuǎn)移最有效的方法。但是這種方法的缺點(diǎn)在于檢測過程中需要破壞CTCs，并且取樣過程中很容易污染，造成檢測結(jié)果呈假陽性，因而限制了這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展[15]。③流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)：CTCs是依靠攜帶熒光物質(zhì)的抗體和腫瘤細(xì)胞特異標(biāo)志物結(jié)合，使得腫瘤細(xì)胞“染色”，然后再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定分析。這項(xiàng)技術(shù)是一種在功能水平上對CTCs進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段。他可以高速分析上萬個(gè)細(xì)胞，同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測得多個(gè)物理、化學(xué)參數(shù)。對細(xì)胞進(jìn)行分析的同時(shí)還可以對細(xì)胞進(jìn)行分選。盡管FCM 檢測方法相對簡便，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，但FCM 檢測方法因在形態(tài)學(xué)方面存在先天不足，因而在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上確認(rèn)腫瘤細(xì)胞，仍然有必要采用鏡下特異性免疫組織化學(xué)染色[16]。④免疫熒光法(immunofluorescence，IF)：是將通過熒光標(biāo)記的特異性抗體在CTC原位進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，再使用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。這項(xiàng)技術(shù)依靠表達(dá)于多數(shù)上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞表面的抗上皮細(xì)胞黏附因子(EpCAM)抗體進(jìn)行免疫磁珠吸附來捕獲CTCs，并用4，62-二脒基-222-苯基吲哚(DAPI)染色(說明捕獲到的細(xì)胞為有核細(xì)胞)進(jìn)一步確定捕獲細(xì)胞的特征，并用抗細(xì)胞角蛋白(CK)抗體(說明捕獲到的細(xì)胞為上皮細(xì)胞)及抗CD45抗體(說明捕獲到的細(xì)胞非白細(xì)胞)進(jìn)行免疫熒光分析。這些研究證實(shí)了CTCs計(jì)數(shù)在常見實(shí)體惡性腫瘤中的臨床意義。目前國際上最常用的CellSearch CTCs檢測系統(tǒng)便是使用免疫熒光法，這項(xiàng)免疫磁珠捕獲EpCAM陽性細(xì)胞的技術(shù)，已被證實(shí)在乳腺癌、前列腺癌及大腸癌具有明確的預(yù)后預(yù)測價(jià)值[17]。但是，這項(xiàng)技術(shù)在肺癌領(lǐng)域的敏感性較低，通過CellSearch系統(tǒng)檢測101例原發(fā)性肺癌患者的CTCs，發(fā)現(xiàn)在7.5 ml外周血中，只有32%的IV期肺癌患者外周血能見到CTCs，IIIa期患者的檢出率為0[18]。這主要是因?yàn)镃ellSearch系統(tǒng)主要通過上皮表型EpCAM來識別CTCs。而肺癌CTCs在遷移入血的過程中通常會發(fā)生EMT，從而丟失了上皮細(xì)胞特征。因此，以上皮表型EpCA M 來檢測肺癌CTCs的方法，可能會產(chǎn)生假陰性的結(jié)果[14]。⑤循環(huán)腫瘤細(xì)胞芯片技術(shù)(CTC-Chip)：第一代的CTCs芯片是一種基于微流體學(xué)的CTCs檢測技術(shù)。它在一張與標(biāo)準(zhǔn)載玻片尺寸相同的硅片上面覆蓋 8 萬個(gè)顯微位點(diǎn)，每一個(gè)位點(diǎn)都包被上能夠捕獲CTCs的抗體。當(dāng)血液樣品通過微流芯片時(shí)，這些位點(diǎn)確保CTCs在流過芯片前捕獲它們。第二代 HB 芯片將微芯片安裝在標(biāo)準(zhǔn)載玻片上，利用標(biāo)準(zhǔn)的，病理檢測方法對癌細(xì)胞進(jìn)行鑒別，在增加血液樣本處理量的，同時(shí)，提高了捕獲罕見CTCs的能力。HB 芯片從幾例患者的血液樣本中捕捉出4～12 個(gè)CTCs群，而過去捕捉的CTCs中從未發(fā)現(xiàn)此類的腫瘤細(xì)胞群。這項(xiàng)新技術(shù)對腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)行更精密的研究以及進(jìn)一步地開展靶向性癌癥治療的臨床研究提供了一個(gè)有力的平臺[19]。

3 小結(jié)

外周血中CTCs的檢測及評估有助于腫瘤的早期診斷，判斷預(yù)后，評估抗腫瘤藥物的療效及制定個(gè)體化治療方案，是一種具有高度可行性和可重復(fù)性的非侵入性新型診斷工具。一般來說，保證特異性前提下的高敏感度、便于臨床應(yīng)用、可重復(fù)性好是CTCs檢測技術(shù)的三個(gè)重要評判標(biāo)準(zhǔn)。CTCs的富集技術(shù)已經(jīng)日趨成熟，通過高效的富集方法，能否通過病理學(xué)手段對循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行病理學(xué)判定，有助于我們對患者進(jìn)行真正的無創(chuàng)“液態(tài)活檢”[20]。但目前CTCs檢測的臨床應(yīng)用仍然存在諸多亟待解決的問題。在未來的研究中，單純CTCs的計(jì)數(shù)是不夠的，通過CTCs基因表達(dá)確定特定亞型可能更為重要。腫瘤患者形成轉(zhuǎn)移可能性，在通過分子生物學(xué)技術(shù)對CTCs的提取、分離及分析中得到與之相關(guān)的信息。未來，“抗CTCs”的治療目標(biāo)將是一個(gè)富有成果的戰(zhàn)略，其從根本上防止轉(zhuǎn)移灶形成，并對復(fù)發(fā)或者接受根治性治療的患者進(jìn)行有針對性的個(gè)體化治療。CTCs的相關(guān)研究中，在不同種類的腫瘤疾病中，有來自不同技術(shù)方的明確證據(jù)顯示外周血中CTCs的數(shù)量及預(yù)后之間存在相關(guān)，對于早期和晚期腫瘤患者的預(yù)后均有相關(guān)。同樣，腫瘤輔助治療過程中CTCs 似乎可以作為療效的指標(biāo)。這是否可取代現(xiàn)有臨床腫瘤檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”CT-斷層影像圖像仍待觀察，但這是令人振奮的前景。CTCs的檢測，是非侵入性的活檢，在NSCLC的研究中我們可以將CTCs與已知的EGFR突變檢測相互結(jié)合，對收集到的CTCs直接進(jìn)行基因分析，反映原發(fā)腫瘤的情況。對于CTCs的研究，未來廣泛實(shí)現(xiàn)使用非侵入性的基因檢測并指導(dǎo)靶向藥物治療，也可能成為臨床肺癌診治的必要手段。

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Advances in the detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer

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