園藝植物小孢子培養技術研究進展

石江鵬，張春芬，李芙蓉，肖蓉，鄧舒，侯麗媛，曹秋芬

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院果樹研究所，山西太原030031；3.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

園藝植物小孢子培養技術研究進展

石江鵬1，張春芬2，李芙蓉1，肖蓉2，鄧舒2，侯麗媛3，曹秋芬3

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院果樹研究所，山西太原030031；3.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

游離小孢子培養已經成為園藝植物現代育種的一項重要內容。綜述了園藝植物小孢子培養的研究進展，詳細討論了小孢子胚胎發生的影響因素，包括材料的基因型、小孢子發育時期、供體植株生理狀況、預處理、活性炭、激素，以及胚狀體分化成苗的影響因素，并提出了相關的問題與展望，以期為園藝植物的培養提供借鑒。

園藝植物；游離小孢子；胚狀體；植株再生

園藝植物是指提供人類食用或觀賞的植物，包括果樹、蔬菜、花卉、茶樹、芳香植物、藥用植物和食用菌等，具有較高的經濟價值[1]。園藝植物產品已成為現代生活中不可缺少的部分，市場需求在逐年增加。采用傳統的方法培育生產園藝植物，由于育種周期長、選擇范圍有限、經濟性狀劣變等，已經不能滿足日益增長變化的市場需求[2]。單倍體育種是現代育種的一項重要內容，即利用組織培養技術誘導產生單倍體植株，再經過染色體自然或人工加倍（如用秋水仙素處理）得到純合的雙單倍體（DH）。這種技術可以縮短育種周期、加快育種進程，提高誘變育種效率，以及加快種質資源創新。

單倍體材料可以通過自然發生和人工誘導獲得，但是一般情況下自然發生概率很小，不能滿足育種工作的需要，游離小孢子培養技術是人工誘導獲得單倍體植物的主要途徑。在蔬菜方面，1982年LICHTER[3]利用小孢子培養技術對甘藍型油菜進行培養，成功獲得了小孢子胚狀體及其再生植株。自此以后，游離小孢子培養技術進入了快速發展階段。1989年，SATO等[4]首次報道成功誘導出大白菜游離小孢子胚和再生植株。在果樹方面，蘋果花藥培養開始于20世紀70年代末，以德國、日本和中國研究較多。1981年，費開韋等[5]獲得元帥花藥培養的單倍體植株；吳絳云[6]經愈傷途徑獲得黃太平花藥培養植株。張春芬等[7]獲得丹霞、富士、嘎拉、紅星、千秋、祝光等品種的再生植株60株，其中，41株系進行了倍性分析，紅星和千秋的植株經SSR檢測均由花粉發育而來。JORDAN[8]在西洋梨花藥培養上獲得小原胚；薛光榮等[9]在錦豐梨的花藥培養上誘導出胚狀體，但誘導率不穩定。在農作物方面，中國科學院遺傳研究所[10]首次利用花藥離體培養方法獲得玉米純系。杭玲等[11]選育出玉米花培雜交種桂三1號，是國內外用花培方法育成的第1個玉米雜交種；同年我國首次育成粳稻品種單豐1號[12]。目前，在蔬菜、作物、果樹上有關小孢子培養技術的報道較多，而在花卉、藥用植物方面的報道相對較少。

筆者綜述了近年來小孢子培養技術在育種上的應用，著重闡述了小孢子胚胎發生的影響因素，以及胚狀體分化成苗的影響因素，并提出了相關的問題與展望，以期為園藝植物的培養提供借鑒。

1 小孢子培養技術在育種中的應用

游離小孢子培養技術是現代新興細胞工程技術。與傳統雜交育種法相比，小孢子培養技術不需要通過長期、繁雜的雜交、回交、自交，就能夠快速得到大量完全純合的個體，便于遺傳分析，而且目標性狀穩定，提高了選擇效率[13]。小孢子培養所獲得的雙單倍體（DH）純合群體可直接用于園藝植物育種，由于配子體基因型豐富，花粉來源的株系在株高、抗性、育性等方面表現多樣化，構成了形態各樣的花培株系[14]。DH系能從親本獲得隨機排列的配子，因此，受隱性基因控制的優良性狀在DH群體中出現較高的頻率。

利用小孢子培養突變方法獲得純合基因型材料用于育種是作物改良的較理想途徑，具有速度快、低或無污染特點。小孢子具有單倍性、單細胞性，因而易于進行物理或化學誘變。誘變后經過一定的處理使得染色體加倍，突變性狀可以直接在當代植株性狀上表現出來，利于提高突變體篩選率[15]。在蕓薹屬植物中，小孢子剛分離后的單核期是應用突變劑的最佳時期，這個時候產生的突變體易于選擇和識別分析[16]。

小孢子是轉基因技術的理想材料，從一個小孢子到一個幼齡的單倍體植株都可以作為外源基因轉化和轉導的受體。與常用的轉基因受體相比，小孢子具有極強的再生能力，能有效獲得轉基因植株[17]。并且單倍體培養體系可以保證轉化后的雙單倍體系的2條染色體均含有目的基因，能最大限度地減少植株出現嵌合現象，降低后代分離[18]。目前，應用于小孢子培養中的轉基因技術主要有農桿菌介導法、顯微注射法、粒子轟擊法等。

2 園藝植物胚胎發生的影響因素

在小孢子培養再生體系建立過程中，胚狀體誘導成功與否是關鍵性的一步。近年來，國內外關于小孢子培養技術不斷發展，對小孢子胚胎誘導因子的研究不斷深入，使園藝植物小孢子胚胎誘導率有了明顯的提高。

2.1 供體植株

2.1.1 基因型基因型對小孢子的產胚率有很大影響，小孢子胚狀體發生能力隨試驗材料基因型不同而有差異。王利英等[19]在茄子小孢子培養的研究中發現，4℃低溫預處理天數并不影響愈傷組織誘導率，愈傷組織誘導率只與基因型有關。曹秋芬等[20]對蘋果9個品種進行了胚狀體誘導，有8個品種獲得了胚狀體，且各品種間誘導率差異顯著，其中，祝光蘋果的花藥胚狀體誘導率最高，可達24.7%，而富士蘋果僅有0.1%。方淑桂等[21]對花椰菜80個品種進行胚狀體誘導，發現有20個供試品種獲得了胚狀體，且胚胎發生率存在顯著差異，最高基因型產胚率是最低基因型產胚率的182.5倍。方輝等[22]對15份不同基因型的青梗菜進行了研究，結果表明，只有10個供試品種獲得胚狀體，其中，GP-2，GP-4，GP-15出胚率相對較高，分別達1.04，0.87，0.89胚/蕾，其余7個品種的出胚率較低，在0.5胚/蕾左右。吳藝飛等[23]在試驗中發現，將出胚率低的品種與出胚率高的品種雜交后，F1出胚率會大大提高，這說明影響出胚的基因是由多對基因控制的，且這種基因是可遺傳的。能否通過優化培養條件來克服基因型對小孢子培養的限制，還需進一步的試驗驗證。

2.1.2 小孢子發育時期小孢子發育時期會影響胚狀體的誘導率，多數研究表明，處于單核靠邊期至雙核早期的小孢子細胞更有利于胚狀體的誘導。張德雙等[24]對綠花菜進行花藥培養比較發現，雙核期影響較大。果樹中的杏樹花藥培養以小孢子發育到四分體或單核期為宜[25]。甜橙和荔枝在單核期培養效果最佳[26-27]。ZHANG等[28]對蘋果花藥培養中花粉發育時期對蘋果胚狀體誘導率的影響進行了詳細的研究，結果表明，低溫處理后單核靠邊期至雙核早期的小孢子最為適宜。

在小孢子培養中，花蕾的外部形態特征（如花蕾長度，花藥顏色、大小，花瓣長/花藥長等）與小孢子發育時期相關，因此，可作為小孢子發育時期的指標[29]。吳藝飛等[23]研究表明，同一紅菜薹品種小孢子發育不同時期和不同品種處于同一小孢子發育時期的花蕾縱徑、橫徑、花萼長度、花瓣長度以及瓣萼比存在顯著差異。在羽衣甘藍游離小孢子培養中，適宜于培養的花蕾形態指標為：花瓣長/花藥長的值為（0.85～1.10）∶1，蕾長3.5～4.5 mm[25]。

2.1.3 供體植株生理狀況研究表明，供體植株的生長條件對小孢子發育同步化程度和胚狀體誘導產生重要影響，不同的生長條件下，供體植株小孢子發育同步化程度和胚狀體誘導存在顯著差異[30]。在玉米小孢子培養研究中，生長期間的最低溫度影響小孢子的胚狀體誘導[31]。在油菜的研究中發現，甘藍型油菜小孢子在單株開1朵花后的14 d時間培養效果最好，白菜型油菜在培養前將花蕾置于4℃胚胎誘導率高，大田氣候條件下小孢子培養最佳取樣時間為上午7：00，此時濕度大，溫度低，小孢子發育同步化程度高[32]。在小麥小孢子培養研究中，病蟲害情況是影響小孢子培養的重要因素，健壯無病蟲害供體植株的小孢子活力強、污染率低，是小麥小孢子培養的最佳材料選擇[33]。

2.2 小孢子培養條件及培養基成分

2.2.1 預處理預處理在小孢子發育中應用較廣泛，包括熱激預處理、低溫預處理及秋水仙素預處理等。預處理能夠改變小孢子的發育途徑。

熱激預處理能夠使小孢子的發育途徑由配子體轉向孢子體，從而增加小孢子培養中的產胚率。高溫熱激預處理的溫度、時間因供體植株的差異而不同。在甘藍研究中發現，不同溫度小孢子發育的途徑不同，小孢子在32.5℃條件下培養趨向于孢子體發育，而在17.5℃條件下培養趨向于配子體發育[34]。

低溫預處理方法在游離小孢子培養中被普遍采用，在甘藍型油菜、青花菜的應用中較多。曾愛松等[35]對甘藍游離小孢子培養初期進行4℃預培養，胚胎發生的誘導作用不大。孫繼峰[36]在青花菜研究中發現，高溫比低溫對小孢子胚胎發生的誘導效率要高，而組合處理的誘導率比單獨的誘導效率高很多。張春芬等[37]在蘋果花藥培養研究中發現，低溫預處理能夠提高蘋果花藥培養形成胚狀體的能力，特別是低溫預處理25 d后，花粉有較高的胚狀體形成能力。

2.2.2 活性炭不少試驗研究表明，小孢子培養過程中，沒有胚胎發生能力的小孢子能釋放出一些有毒物質，會降低胚狀體發生頻率，改變胚的形態。在培養基中加入適量的活性炭后，可加快離體培養進程，提高小孢子產胚率，對小孢子培養有十分重要的作用[38]。

活性炭并非對所有培養材料的小孢子培養都能起作用。田保明等[39]對油菜TR9和TR4這2種材料進行研究，結果表明，添加活性炭0.5 mg/L分別是未添加的對照小孢子胚產量的1.82倍、1.21倍。而劉雪平等[40]研究表明，濃度為0.05%的活性炭對甘藍型油菜小孢子再生胚促進作用不明顯。研究發現，活性炭處理獲得的胚狀體在萌發、成苗等方面都差于未經活性炭處理的小孢子胚，原因可能是活性炭不僅吸收游離小孢子培養中的有害物質，還吸收一些生長調節劑、鐵鹽、維生素等與胚發生密切相關的物質[38]。因此，對于不同試驗材料的活性炭最適濃度還需進一步探究，否則會起負作用。

2.2.3 激素在游離小孢子誘導培養中，添加不同的植物生長調節劑對園藝植物胚狀體誘導的影響存在差異。近年來，國內外學者對6-BA和NAA對小孢子胚胎發生的影響研究較多。在小白菜游離小孢子的研究中，李巖等[41]研究表明，在培養基中添加少量6-BA和NAA激素與不加生長調節劑的對照相比，其產胚率明顯提高；徐艷輝等[42]研究發現，添加6-BA可以提高大白菜胚狀體的誘導率，但是它對難出胚狀體的品種仍沒有效果，而高濃度的6-BA會對易出胚狀體的品種起抑制作用；付文婷等[43]研究表明，有些易出胚狀體的大白菜不加任何激素也能出胚，添加激素反而出胚少或不出，而且添加激素會產生畸形胚。可見，有關外源激素對植物游離小孢子培養作用的研究還未達成一致的結論，關于難出胚材料的激素配比、激素選擇還需進一步研究。ZHANG等[44]研究表明，在蘋果花藥培養過程中培養基激素的濃度影響胚胎形成率。

3 園藝植物小孢子胚分化成苗的影響因素

在游離小孢子培養中，小孢子胚分化成植株是重要的環節之一。研究發現，影響胚發育成植株的外部因素有植株再生所需的培養基組成、溫度、光照條件、通氣狀況等，內部因素有胚狀體的生理狀況、胚齡的長短等。

胚狀體的形態特征影響胚狀體發育成植株，健康的子葉型胚轉到成苗培養基上后成苗能力最強，魚雷型胚狀體的再生能力很差，球型胚幾乎不能發育成正常的植株。胚齡的長短對胚狀體成苗影響很大，胚齡過長和過短均不利于成苗。胚齡過短，胚狀體容易出現玻璃化或黃化，生長不良而死；胚齡過長，胚狀體分化能力減弱，易褐化導致成苗率下降[23]。

低溫處理對胚狀體的成苗率也有一定的影響。HANG等[45]研究表明，低溫處理甘藍型油菜能迅速直接成苗；在對油菜小孢子胚狀體出苗率影響的研究中發現，把胚狀體轉移到固體培養基上先低溫（2℃）培養，然后常溫培養，可提高直接成苗率[46]；余鳳群等[47]將甘藍型油菜小孢子胚狀體轉至固體培養基后，置于10℃低溫誘導10 d，直接成苗率達到51.2%，明顯優于未經過低溫處理的對照。

培養基成分是小孢子胚芽分化的重要影響因素。劉凡等[48]研究發現，胚狀體在NLN13液體培養基中培養20～25d后，轉接到固體分化培養基中成苗效果最好。付文婷等[43]研究表明，在B5培養基上對大白菜的小孢子胚進行培養，植物生長調節劑配比對叢生芽的產生有重要影響，各處理叢生芽誘導率有很大差異。張亞麗等[2]在不含任何激素的B5培養基上，白菜胚狀體均發生愈傷化，最終褐化死亡。

4 展望

隨著單倍體育種體系的不斷發展，游離小孢子培養體系進一步得到完善。小孢子培養技術作為一種高效、安全、快速的育種手段受到了越來越多國內外學者的重視。園藝植物和人類密切接觸，栽培量逐年上升，已成為提高生活質量的重要指標之一。通過分析小孢子培養技術研究進展，小孢子胚胎發生、胚狀體分化成苗的影響因素，發現有幾個方向的研究還存在不足，今后的研究應集中在以下幾個方面進行。

（1）有關小孢子培養技術的報道較少，且這些研究所用的材料多為作物和蔬菜，而有關果樹和花卉的游離小孢子培養的報道更少。在前人已有的研究基礎上，需要進一步完善花卉、果樹游離小孢子培養體系。

（2）根據國內外學者的研究結果，影響小孢子胚胎發生的因素主要有基因型、小孢子發育所處的時期、小孢子的生理狀況、培養基和培養條件等，制約胚分化成植株的因素主要有培養基組成、溫度、通氣狀況、生理狀況等。如何打破小孢子胚胎發生以及胚分化成苗的制約因素，還需研究人員繼續探索。

（3）探明小孢子胚胎發生過程中的遺傳表現以及染色體加倍的時間、原因等，對小孢子培養進行進一步的遺傳改良，提高育種的選擇效率，加速育種進程，為園藝植物小孢子培養技術的應用提供更為廣闊的前景。

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Research Advances on Microspore Culture Technology of Horticultural Plants

SHI Jiangpeng1，ZHANGChunfen2，LI Furong1，XIAORong2，DENGShu2，HOULiyuan3，CAOQiufen3
（1.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofPomology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Research CenterofBiotechnology，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan 030031，China）

Microspore culture became an important content of modern breeding of horticultural plants.This paper reviewed the research progress in microspore culture of horticultural plants,factors affecting microspore embryogenesis were discussed in detail, including genotype,microspore development,donor plant physiological status,pretreatment,activated carbon,hormone,and factors affecting the differentiation ofembryoid bodies into seedlings.And the paper put forward the problems and prospects to provide reference for the cultivation ofhorticultural plants.

horticultural plants;isolated microspore;embryoid;plant regeneration

S601

A

1002-2481（2017）04-0669-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.43

2016-12-27

國家自然科學基金項目（31372033）；山西省國際合作項目（2014081040）；山西省農業科學院博士基金研究項目（YBSJJ1515）

石江鵬（1992-），女，山西忻州人，在讀碩士，研究方向：種質資源創新與利用。曹秋芬為通信作者。