不同濃度TGF-β1對人髓核細胞外基質成分基因表達的調控作用比較＊

張榮峰，孫新君，張超，阮狄克

基礎醫學

不同濃度TGF-β1對人髓核細胞外基質成分基因表達的調控作用比較＊

張榮峰，孫新君，張超，阮狄克

目的研究在體外培養條件下，不同濃度轉化生長因子-β1（TGF-β1）對人髓核細胞聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型膠原及SOX-9基因表達的調控作用。方法以傳2代人髓核細胞為研究對象，分別以0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L、100μg/L四種濃度的TGF-β1為培養液，設不含生長因子培養液為對照組，應用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測Aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX-9 mRNA表達情況。結果0.1μg/L TGF-β1組與對照組相比，無顯著性差異。1μg/L、10μg/L和100μg/L TGF-β1組在促進Aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX-9基因表達方面作用顯著，差異均具統計學意義。其中，10μg/L組促進細胞mRNA表達作用最明顯。結論TGF-β1能夠促進髓核細胞Aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX-9基因的表達，提示TGF-β1有可能在椎間盤退行性疾患的預防和治療中發揮重要作用。

轉化生長因子-β1；髓核細胞；基因表達；聚集蛋白聚糖；Ⅱ型膠原；SOX-9基因

椎間盤退變引起的頸肩痛、腰腿痛十分常見，當前的治療方法雖然能夠解除疼痛，但不能修復退變的椎間盤。只有通過細胞學的方法維持細胞外的正常基質成分，從而重建椎間盤的高度和生物學性能，才能從根本上阻止或延緩椎間盤退變；髓核細胞作為分泌髓核內基質的主要載體，其在正常髓核組織內數目較少，在體外培養條件下容易發生去分化，喪失正常的細胞表型，這就限制了髓核細胞生物學治療的應用［1］。通過生長因子的方法，刺激髓核細胞合成細胞外基質，為逆轉椎間盤退變帶來了新思維［2］。本實驗通過研究不同濃度TGF-β1對人正常髓核細胞Aggrecan和Ⅱ型膠原基因、SOX-9基因表達的調控作用，來探索早期阻止或逆轉椎間盤退變的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和髓核組織來源HAM’S/F12培養液、胎牛血清、胰蛋白酶（HyClone公司，美國），Ⅱ型膠原酶（Gibco公司，美國），MTT、DMSO（Sigma公司，美國），培養瓶、培養板（Corning公司，美國），rh-TGF（Peprotech公司，美國），引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成，Trizol reagent試劑（Gibco公司，美國），反轉錄試劑盒（日本Takara公司）。人髓核組織取自青少年脊柱側彎矯形手術患者。

1.2 細胞分離與培養取得髓核組織后，立即在超凈工作臺內篩選實驗用的髓核組織，去除纖維環及交界區組織，用PBS沖洗后剪成碎組織塊，用0.25%的胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min搖動一次，800～1000 rpm離心5min，去上清液，用0.2%的膠原酶于37℃下消化4 h，120目尼龍網篩過濾，細胞懸液1000 rpm離心5min，棄去上清液，D-Hanks液懸浮細胞，1000 rpm，離心5min，進行酶液清洗，共三次。清洗后的細胞，用F12-10%FBS（胎牛血清）2m l稀釋，臺盼蘭染色，計數板進行細胞計數。以2×104細胞/cm2接種在75 cm2培養瓶中，置37℃、5%CO2培養箱中培養。隔2～3 d換液、細胞生長達80%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 總RNA提取和RT-PCR取處于對數生長期的傳2代人髓核細胞，達80%融合后，1000 rpm離心后，去上清，用含10%FBS的F12培養液調整細胞濃度為1×104/m l，按1∶5接種于5個75 cm2培養瓶，24 h后，吸出培養基，分別加入由10%FBS/ F12配制成的0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L、100μg/L四種濃度的TGF-β1，對照組不加生長因子。培養瓶內的各組細胞培養72 h，按照Gibco公司Trizol一步法說明，提取各組細胞的總RNA，紫外分光光度儀測純度與濃度。取2μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明，用AMV反轉錄酶進行反轉錄，反轉錄后獲得的cDNA通過Real-Time PCR對蛋白多糖、Ⅱ型膠原、SOX-9進行擴增。以管家基因磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參。引物序列根據文獻報道合成［3］：GAPDH上游：5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3'，下游5'-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3'；PCR的反應條件均為：94℃30 s，52℃45 s，72℃45 s，30個循環。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳圖片用IBAS2.5圖像處理系統分析，以Aggrecan和Ⅱ型膠原吸光度與GAPDH吸光度的比值作為其相對表達量。

以上實驗重復3次。

1.4 統計學分析用SPSS 15.0軟件中的One-Way ANOVA法，對實驗測得的吸光度值數據進行統計學分析，檢測結果以x±s表示，比較試驗組和對照組間的吸光度值差異，結果進行t檢驗，P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

10%血清條件下，在Aggrecan表達方面，對照組的吸光度比值為0.775±0.024，TGF-β1 0.1μg/L組的吸光度比值為0.828±0.008，與對照組相比，無顯著性差異，1μg/L、10μg/L、100μg/L組的吸光度比值分別為1.361±0.016、1.814±0.029、1.163±0.027，與對照組相比，差異具有統計學意義。在促進Ⅱ型膠原基因表達方面，與對照組的吸光度比值1.312± 0.036相比，TGF-β1 0.1μg/L組無顯著性差異（P> 0.05），1μg/L、10μg/L、100μg/L組差異均具統計學意義，其中，10μg/L組促進細胞表型基因mRNA表達作用最明顯。在促進SOX-9基因表達方面，與對照組相比，0.1μg/L組無顯著性差異（P>0.05），1μg/ L差異有統計學意義（P<0.05）、10μg/L、100μg/L組差異非常顯著（P<0.01）。

3 討論

椎間盤退變是一種發病率及致殘率極高的疾病，常引起以頸腰腿痛，其中髓核組織在椎間盤退變過程中起首要的作用［4］。正常髓核組織呈膠凍狀，主要是軟骨特異性基質成分蛋白聚糖和Ⅱ型膠原組成，與軟骨組織相比，髓核組織中蛋白多糖的含量相對較高，比較髓核內和軟骨內蛋白多糖與Ⅱ型膠原的比例，髓核組織約為27∶1，而軟骨組織只有2∶1［5］。蛋白多糖被包埋在由Ⅱ型膠原組成的網格中，其中Aggrecan是蛋白多糖的主要成分，吸附水分的能力特別強大，因此，正常髓核組織含水量非常豐富，可達80%，具有屈曲性和黏彈特性，能夠承受壓力、吸收震蕩［6］。髓核組織為無血管組織，營養的供給主要通過組織間的彌散和滲透，長期承受壓應力、剪切力，極易發生退變。退變后Aggrecan和Ⅱ型膠原逐漸減少，Ⅰ型膠原增多，促使髓核結構逐漸纖維化，喪失承受壓力的能力，并導致纖維環、軟骨終板的退變。

目前治療椎間盤退變性疾病的方法包括保守治療和手術治療，這些措施雖能緩解癥狀，并不能解決椎間盤本身的退變問題，其遠期療效并不理想［7］。隨著組織工程及再生醫學的發展，以細胞為基礎的生物學治療修復退變的椎間盤逐漸成為國內外學者的方向［8，9］，而利用細胞因子的作用，提高髓核細胞的活性，促進正常細胞外基質的合成，為延緩或逆轉椎間盤退變的進程提供了可能。TGF-β1是一種分子量為25 kd的雙鏈多肽，具有促進細胞增殖，調節細胞分化，促進細胞外基質合成功能［10］。本課題組之前的研究提示，在10%血清條件下，TGF-β1能提高細胞的增殖活性，并且在1~10μg/L的濃度范圍內呈劑量效應關系［11］。

由于髓核細胞缺乏特異性細胞標志，國內外研究中通常選用蛋白多糖、Ⅱ型膠原和SOX-9作為髓核細胞的特異性標記。SOX-9基因是促進軟骨細胞分化和維持軟骨細胞表型的調控基因，與椎間盤退變密切相關，它能增加椎間盤基質中Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，延緩椎間盤退變的發展［12］。本研究結果提示，TGF-β1在1～100μg/L濃度時對可以顯著促進Aggrecan和Ⅱ型膠原基因、SOX-9基因的表達，說明在體外培養條件下，TGF-β1對人髓核細胞的表型表達具有重要的促進和維持作用，特別是在濃度10μg/L時調控作用最顯著。這就使體外培養髓核細胞作為組織工程椎間盤的種子細胞成為可能。

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［2016－07－13收稿，2016－08－11修回］［本文編輯：宋敏］

Com parative study on the regulation effects of TGF-β1 at d ifferent concentration in vitro on cellular aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of hum an nucleus pulposus

ZHANG Rong-feng①，SUN Xin-jun，ZHANG Chao，et al.①Department of Orthopedics，the 89th Hospital of People's Liberation Army，Weifang，Shandong 261000，China

Objective To investigate the regulation effects of TGF-β1 on aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of human nucleus pulposus at different concentration in vitro.Methods Passage 2 nucleus pulposus cells were cultured in the medium with 10%FBS and at different concentrations（TGF-β1 as 0.1μg/L，1.0μg/L，10μg/L，100μg/L）.The medium without TGF-β1 was taken as control group.The mRNA expression of aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene was assayed by RT-PCR.Results The 0.1μg/L TGF-β1 group hadn't significant difference compared with the control group.The 1μg/L，10μg/L and 100μg/L groups，promoted mRNA expression of aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene compared with the control group，the difference had statistical significance.Conclusion TGF-β1 is efficient to promote aggrecan，collagenⅡand SOX-9 gene expression of human nucleus pulposus which might be a future therapeutic potential in the treatment of intervertebral disc degeneration.

Transforming growth factor-β1；Nucleus pulposus cells；Gene expression；Aggrecan；CollagenⅡ；SOX-9 gene

R681.5+3

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.01.017

國家自然科學基金項目（30370389）

261000山東濰坊，解放軍89醫院骨科（張榮峰，孫新君）；100037北京，海軍總醫院骨科（張超，阮狄克）