流式細胞術的發展歷史及在獸醫學中的應用

王琳

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱150069）

流式細胞術的發展歷史及在獸醫學中的應用

王琳

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱150069）

流式細胞術作為一種對單細胞定量分析和分選的新技術已廣泛應用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等研究領域，文章對其發展及在獸醫學中的應用作以綜述。

流式細胞術；發展；應用

Abstract:As a new technique for single cell quantitative analysis and separation,flow cytometry has been widely used in research field of immunology,hematology,oncology,cell biology,cytogenetics, biochemistry and so on.This article reviewed the development and application of flow cytometry in veterinary medicine.

Key words:flow cytometry;development;application

流式細胞術（FCM）是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數，與傳統的熒光顯微鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優點，成為當代比較先進的細胞定量分析技術[1]。

1 流式細胞術的發展歷史

1.1 流式細胞術儀器的發展

1930年Casperrsson和Thorell開始致力于細胞的計數；1934年世界上最早設想使細胞檢測自動化的人Moldaven試圖用光電儀記錄流過1根毛細管的細胞數量，開創了流式細胞自動計數的基礎；1936年Caspersson等引入顯微光度術；1940年Coons提出用結合熒光素的抗體去標記細胞內的特定蛋白；1947年Guclcer運用層流和湍流原理研制煙霧微粒計數器；1949年Coulter提出在懸液中計數粒子的方法并獲得專利；1950年Caspersson用顯微分光光度計在紫外（UV）和可見光光譜區檢測細胞；1953年Croslannd-Taylor應用分層鞘流原理，成功地設計紅細胞光學自動計數器；Parker和Hutcheon描述一種全血細胞計數器裝置，成為流式細胞儀的雛形；1954年Beirne和Hutchcon發明光電粒子計數器；1959年B型Coulter計數器問世；1965年Kamemtsky等提出兩個設想：用分光光度計定量細胞成分和結合測量值對細胞進行分類；1967年Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基礎上提出細胞分選的方法；1969年Van Dilla Fulwyler及其同事們在LosALmos，NM（即現在的National Flow Cytometry Resource Labs）發明第一臺熒光檢測細胞計；1972年Herzenberg研制出一個細胞分選器的改進型，能夠檢測出經熒光標記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號[2]。進入20世紀80年代和90年代，流式細胞儀除了在70年代儀器基礎上進行完善多光束、多參數技術外，在技術原理和設計研制方面似乎沒有突破性的進展。

現今流式細胞儀在各種功能上有很大提高，隨著光電技術的進一步發展，流式細胞儀已開始向模塊化發展，即其光學系統、檢測器單元和電子系統都可以按照實驗要求隨意更換[3]。進入21世紀，流式細胞術已經日臻完善，成為分析細胞學領域中無可替代的重要工具。

1.2 流式細胞術方法學的發展

從FCM發展史看，初始10年是以測定單細胞內DNA含量或RNA含量、蛋白質或線粒體等大分子結構，研究細胞增殖動力學為重點。在20余年中，FCM方法學的發展十分迅速。1974年Hoffman和Laris首先用FCM檢測了紅細胞的膜電位；1975年Milstein和K?hler建立了單克隆抗體技術；1979年Kung等就用該技術在FCM上區分了人類T淋巴細胞亞群抗原。以后Loken又利用單激光束研究了同一細胞的兩種抗原。1975年Gratzner等建立溴脫氧尿嘧啶核苷摻入增殖細胞，用FCM檢測的方法了解了細胞的增殖活性。1976年Darzynkienicz等建立對同一細胞DNA-RNA相關測量的方法[4]。1979年Visser等用FCM測量了細胞中pH的變化。Valet等建立了用FCM測量細胞表面電荷的方法。1980年Thorell建立了用FCM測量細胞內氧化還原狀態的方法。1982年Oi發明了新一代免疫熒光染料——藻膽蛋白系列，拓寬了FCM的研究領域，使熒光免疫技術有了進一步的發展。近幾年隨著流式細胞術的發展，在一個樣品可以同時檢測雙色、三色及四色熒光染料標記的單克隆抗體，這對研究不同抗原間的關系提供了方便，使流式免疫熒光標記研究也獲得了充分發展[5]。近年來出現了許多FCM的靈活數據分析軟件，以不同圖像顯示多參數之間的相關性，進一步推動了FCM技術的發展[6]。

2 流式細胞術在預防獸醫學中的應用

2.1 淋巴細胞亞群分析

人及動物體內白細胞表面標志是評價機體免疫狀態的基礎。流式細胞術不僅能檢測機體3大免疫細胞的數量，包括T細胞（CD3+CD19-細胞）、B細胞（CD19+CD3-細胞）和NK細胞（CD3-/CD（16+56）+細胞），而且還可以檢測3大免疫細胞的活性細胞水平，包括活性T細胞（CD3+/HLA-DR+細胞）、活性B細胞（CD19+/CD5+細胞）和活性NK細胞（CD（16+56）+/Fas配體+細胞）。T細胞是機體免疫的核心細胞。末梢血T細胞發育為功能不同的亞群，各亞群的數量和功能發生異常時，就可能導致機體免疫紊亂并發生一系列的病理變化。在各種疾病發生發展過程中用不同的T細胞表型標志物來測定人外周血細胞中T輔助/誘導細胞亞群（CD3+CD4+細胞）和T抑制/細胞毒細胞亞群（CD3+CD8+細胞），及二者的比值（CD3+CD4+/CD3+CD8+）來評價體內細胞免疫調節平衡狀態。利用CD4和CD29、CD45-RA單克隆抗體可以將CD4細胞群分為CD4+CD45RA+的T抑制細胞誘導亞群及CD4+CD29+的T輔助細胞誘導亞群；也可以利用CD8和CD28單抗將CD8細胞分為CD8+CD28+的細胞毒T細胞亞群和CD8+CD28-的T抑制細胞。T細胞亞群的檢測可以幫助研究各種與免疫有關的疾病發病機制，特別是T細胞的免疫調節功能[6]。

2.2 微生物鑒別

流式細胞術可對大數量細菌逐個快速的進行多參數精確測量，現在多數用于對酵母菌和各類細菌的測量與分析。酵母菌的測量在技術上比較簡單，自身體積大，其DNA含量約為人類二倍體細胞DNA含量的1/200?，F在已用定量DNA、RNA和光散射方法來研究酵母菌的細胞周期。此外，也采用同樣的方法對原生生物、藻類和霉菌類以及各種重金屬對其的影響進行了研究。另外用FITC結合的抗血清可作種系鑒別，應用此項技術已能代替臨床上經典的費時繁瑣的細菌抗生素敏感試驗和傳染活性的測定。在工業中，流式細胞術可用于快速微生物鑒定，如對飲用水及原油中的微生物鑒定與控制。

3 流式細胞術新技術的應用

3.1 液相芯片技術

生物芯片技術是近幾年來隨著人類基因組計劃和蛋白質組計劃的進展在生命科學領域中迅速發展起來的一項新技術，現已被大家所熟知。其將生物芯片技術和FCM有機結合在一起，把不同生物探針（核酸、蛋白等）標記在各種有熒光的微球上，以熒光標記微球作為反應載體在液相系統中完成生物學反應，即為流式細胞術液相芯片技術[7]。其組成由微球體+探針+目的分子+報告分子的一種簡單反應模式，可以在同一液相中同時檢測多個目的分子，如對血液中多種白細胞介素檢測。

3.2 定量流式細胞分析

定量流式細胞分析是指采用流式細胞術對細胞或微粒上標記熒光分子的定量分析，從而對細胞的生物分子進行精確測量，如每個分子表達的平均分子數、抗原數等[8]。定量流式細胞分析不同于以往的相對熒光強度或陽性細胞百分率測量，更為準確、靈敏，如在獲得性免疫缺陷綜合征和“非典”的研究與治療中，對外周血中的CD4+T淋巴細胞進行絕對記數，來反映病情進展及監測療效[9]。

[1]左邊富.流式細胞術與生物醫學[M].沈陽∶遼寧科學技術出版社,1996.

[2]魏熙胤,牛瑞芳.流式細胞儀的發展歷史及其原理和應用進展[J].現代儀器,2006（4）∶8-11.

[3]趙泓,劉凡.流式細胞儀[J].安徽農學通報,2006,12（12）∶39-41.

[4]Taylor J D,Briley D,Nguyen Q,et al.Flow cytometric platform for high-throughput single nucleotide polymorphism analysis[J].Biotechniques,2001,30（3）∶661-666.

[5]Alamo A L,Melnick S J.Clinical application of four and five-color flow cytometry lymphocyte subset immunophenotyping[J].Cytometry,2000,42（6）∶363.

[6]沈關心,周汝麟.現代免疫學實驗技術（第二版）[M].武漢∶湖北科學技術出版社,2002.

[7]Hall S E,Dvorak W S,Johnston J S,et al.Flow cytometric analysis of DNA content for tropical and temperate new world pines[J].Annals of Botany,2000,86（6）∶1 081-1 086.

[8]Maecker H T.Cytokine flow cytometry[J].Methods Mol Biol,2004,263∶95-108.

[9]耿慧霞,王來,王強.流式細胞儀在生物學中的應用[J].生物學雜志,22（4）∶44-45.

The Development of Flow Cytometry and Its Application in Veterinary Medicine

WANG Lin

（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

Q291；S85

A

1001-0084（2017）09-0039-02

2017-08-06

王琳（1982-），女，遼寧錦西人，中級獸醫師，主要從事疫苗生產。