噬菌體制劑的研究現(xiàn)狀及其前景

裴宗飛

（山東省綠色食品發(fā)展中心 山東 濟南 250022）

噬菌體制劑的研究現(xiàn)狀及其前景

裴宗飛

（山東省綠色食品發(fā)展中心 山東 濟南 250022）

噬菌體是一類病毒，因其感染原核生物，又叫做細(xì)菌病毒。早在1915年及1917年，英國著名的細(xì)菌學(xué)家Twort與法國的D’Herelle分別發(fā)現(xiàn)了噬菌體的存在。在噬菌體發(fā)現(xiàn)之初，科學(xué)家們便意識到其在細(xì)菌性疾病防制方面的應(yīng)用價值，故做了大量試驗研究其生物學(xué)特性。隨著抗生素的出現(xiàn)，其研究被中斷。當(dāng)前耐藥菌株不斷出現(xiàn)及人們生物安全觀念不斷深化，噬菌體在細(xì)菌疾病方面的應(yīng)用價值被重新重視起來，學(xué)者們又投入到對噬菌體的研究中，期望通過對其深入的研究，更好地應(yīng)用于細(xì)菌疾病的治療與預(yù)防。

噬菌體(Bacteriophage)是以細(xì)菌為宿主的一類病毒，所以又稱為細(xì)菌病毒，它廣泛存在于自然界中，在絕大多數(shù)原核生物中都發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的噬菌體。據(jù)報道通過電鏡觀察到的噬菌體至少已有2850種(株)，其中有2700種(株)是有尾的，大腸桿菌噬菌體發(fā)現(xiàn)的最多，大腸桿菌也是研究得最深入的一種宿主。如A類中的T2、T4、T6，B類中的T1、T5、λ，C類中的T3、T7，D類中的ΥX174，E類中的F2、MS2，F(xiàn)類中的Fd、Fl、M13 等都屬于大腸桿菌的噬菌體。噬菌體分為溫和性噬菌體和烈性噬菌體，烈性噬菌體感染細(xì)胞后可立即在宿主細(xì)胞內(nèi)開始自身的生命循環(huán)，引起細(xì)菌細(xì)胞的裂解。溫和性噬菌體侵入宿主細(xì)胞后，其核酸附著并整合到宿主染色體上和宿主核酸同步復(fù)制。隨宿主菌的增殖而增殖的噬菌體稱為前噬菌體。如果宿主菌遇到某種不利環(huán)境條件，前噬菌體可能被激活進(jìn)而裂解宿主細(xì)胞。從噬菌體制劑的角度考慮，溫和噬菌體的實用價值不高，通常提到的噬菌體均為烈性噬菌體。

1 噬菌體制劑及其治療特點

自從發(fā)現(xiàn)活噬菌體有治療細(xì)菌感染的價值后，研究者已經(jīng)建立了很多動物治療模型以發(fā)掘其潛能。類似的報道有關(guān)于實驗動物的，也有經(jīng)濟動物的，但總體數(shù)量較少，而且多用于研究常見細(xì)菌感染的治療。出于安全性考慮，關(guān)于人的報道較少。在用分枝桿菌噬菌體TM4和D29治療結(jié)核感染小鼠的試驗中，分別得出了不同的研究結(jié)果，可能是由于研究者使用的試驗材料和方法不同，因此對結(jié)核病的治療效果還需進(jìn)一步探索。豬沙門氏菌及大腸桿菌感染小鼠的試驗證實，用噬菌體治療具有明顯的效果。在人MRSA感染的臨床試驗中，噬菌體也被證明有可靠的療效。

1.1 裂解酶的治療 裂解酶(lysin或endolysin)是雙鏈DNA噬菌體在自身復(fù)制晚期合成的一類細(xì)胞壁水解酶，又稱內(nèi)溶素或溶胞壁酶。因為裂解酶能作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，破壞細(xì)菌保護層，所以可作為起殺菌作用的治療藥物。該酶對革蘭氏陽性菌作用較強，已經(jīng)作為一種新型殺菌制劑被廣泛應(yīng)用于治療化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等引起的感染性疾病。裂解酶制劑與抗生素相比，所用劑量小、特異性強。有試驗將化膿性鏈球菌長時間暴露于含低濃度裂解酶的平板上，連續(xù)傳代40次仍不產(chǎn)生耐藥性，但如果使兩者長時間接觸后是否會產(chǎn)生耐受性，還無試驗證明。與噬菌體相比，裂解酶的裂解譜更廣，機體對裂解酶產(chǎn)生的抗體不會削弱其殺菌作用。使用單一性質(zhì)的裂解酶會限制其應(yīng)用范圍，所以具有多種性質(zhì)的嵌合性裂解酶將會是未來研究的熱點。

1.2 治療載體 有些噬菌體能表現(xiàn)出溶源化等現(xiàn)象，因此可被用于運載抗癌藥物、非特效藥、殺菌劑或者編碼致死性殺菌蛋白的基因到相應(yīng)的病原體侵染部位，直接與病原體結(jié)合或?qū)⑵涑休d的物質(zhì)注入病原體感染細(xì)胞內(nèi)。在這些人為構(gòu)造的載體系統(tǒng)中，噬菌體雖沒有真正起到治療作用，卻解決了難以使藥物直接在體內(nèi)接觸目標(biāo)的難題。利用噬菌體裂解酶能夠使對應(yīng)的宿主菌變成一個空殼)))菌影，該物質(zhì)因保留了一套完整的抗原而可作為口服疫苗開發(fā)的對象，又因無致病性而可作為藥物、酶等的載體。

1.3 噬菌體治療的特點 雖然早期噬菌體制劑的治療效果不理想，但不能因此否認(rèn)噬菌體在臨床應(yīng)用中的價值，噬菌體治療有許多潛在的優(yōu)勢。（1）從噬菌體的特性來看，噬菌體可以隨宿主菌的增殖而增殖，并在細(xì)菌感染的整個過程中發(fā)揮作用，而不像抗生素那樣隨著時間的推移療效逐漸降低。（2）在解決耐藥性問題上，噬菌體具有高度的宿主特異性，可以殺滅特定的菌型，并可以減輕由于用藥所帶來的體內(nèi)菌群失調(diào)，同時減少由之所帶來的耐藥性問題，其原因是噬菌體能靶向到達(dá)細(xì)菌表面受體，從而弱化耐藥突變。另外噬菌體可以單獨使用，也可以與其它抗生素聯(lián)合使用以減少耐藥性問題。（3）從應(yīng)用方面來看，噬菌體的副作用很小。對于那些對抗生素敏感的人來說，噬菌體制劑更是一種理想的治療途徑。準(zhǔn)確選擇相應(yīng)的噬菌體也可作為預(yù)防用制劑。而且噬菌體制劑獲取比較方便，價格比較低廉。

2 噬菌體制劑作用機理

噬菌體制劑作用于細(xì)菌有兩種方式：（1）第一種方式為裂解途徑，烈性噬菌體(Virulentphage)感染敏感細(xì)菌后，可在其細(xì)胞內(nèi)快速增殖并使之裂解。裂解是一個高度調(diào)節(jié)的程序化過程，其經(jīng)典模式是孔蛋白—內(nèi)溶素途徑?？椎鞍卓刂苾?nèi)溶素的含量，而內(nèi)溶素的多少決定了裂解的時間。噬菌體進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后利用細(xì)菌體內(nèi)的酶系統(tǒng)，進(jìn)行其自身生物物質(zhì)的合成。然后子噬菌體以裂解方式從細(xì)菌體內(nèi)涌出，造成細(xì)菌的死亡。例如T系噬菌體侵入大腸桿菌(B系)的過程約需30 min便能引起被侵入菌的裂解。（2）第二種方式是通過噬菌體的分泌物—內(nèi)溶素而起作用的，內(nèi)溶素是噬菌體進(jìn)入宿主菌后利用細(xì)菌體內(nèi)的物質(zhì)合成的一類酶蛋白。根據(jù)宿主菌的不同可分為兩類:革蘭氏陽性菌內(nèi)溶素和革蘭氏陰性菌內(nèi)溶素。革蘭氏陰性菌有三種不同原型的內(nèi)溶T4gpe、λR和T7，這三種內(nèi)溶素都是可溶性的且小于20Kda的球蛋白；革蘭氏陽性菌的內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)復(fù)雜且分子量大于或等于30Kda，C末端有一個直接與細(xì)胞壁結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能夠高度特異性的識別細(xì)菌細(xì)胞壁決定簇。結(jié)合區(qū)域可以幫助酶在厚厚的細(xì)胞壁中保持活性，并且一旦孔蛋白引發(fā)了裂解反應(yīng)，將更加迅速和徹底的破壞細(xì)胞壁。這些結(jié)合區(qū)域的存在以及高度的專一性，使噬菌體可以作為一種新型的抗菌制劑使用。而革蘭氏陰性菌的內(nèi)溶素則缺乏這些區(qū)域。通過生物工程技術(shù)分離提純內(nèi)溶素，用于臨床感染治療。既可以保證治療的高效性，又具有較高的安全性。例如，噬菌體C1的內(nèi)溶素粗制品，納克級就可以在5s內(nèi)殺死107個肺炎鏈球菌。同樣數(shù)量的內(nèi)溶素可以有效預(yù)防和治療小鼠口腔中的鏈球菌。如果使用不同的酶不同的方式攻擊胞壁質(zhì)，內(nèi)溶素對鏈球菌的致死性表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。因此，在生產(chǎn)中我們可以利用各種酶蛋白不同的組合，擴大宿主譜有效治療生產(chǎn)中存在的多重感染。

3 噬菌體制劑的應(yīng)用

細(xì)菌性疾病一直困擾著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，每年此防和治療這些疾病，花費了大量的資金。治療細(xì)菌病的常用方法是使用各種抗生素，但隨著大量耐藥菌的出現(xiàn)，抗生素對各種細(xì)菌的抑菌效果已達(dá)不到預(yù)期的要求。而且隨著多種新型抗生素的出現(xiàn)，細(xì)菌的耐藥譜也在不斷擴展，因此急需研制新型抗菌制劑來解決耐藥性問題。噬菌體作為一種新興的治療方法，已經(jīng)越來越受到醫(yī)療機構(gòu)的關(guān)注，美國醫(yī)療機構(gòu)在1999年的國際噬菌體會議上預(yù)測，在未來的3～5年內(nèi)，美國醫(yī)院將使用噬菌體制劑治療抗生素?zé)o法控制的感染。

4 噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用現(xiàn)狀

（1）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中治療細(xì)菌性疾病的常用方法是使用各種抗生素，但隨著大量耐藥菌的出現(xiàn)，抗生素對各種細(xì)菌的抑菌效果已達(dá)不到預(yù)期的要求1而且隨著多種新型抗生素的出現(xiàn)，細(xì)菌的耐藥譜也在不斷擴展，因此急需研制新型抗菌制劑來解決耐藥性問題1噬菌體作為一種新興的治療方法，已經(jīng)越來越受到醫(yī)療機構(gòu)的關(guān)注。（2）近年來，人們對海洋環(huán)境中噬菌體的研究興趣日益增長。隨著技術(shù)的發(fā)展，海洋環(huán)境中噬菌體的存在及其重要作用得到了認(rèn)可一電子顯微鏡研究結(jié)果表明，海水中噬菌體的數(shù)量可達(dá)104～107pfu/ml海洋中的細(xì)菌，藍(lán)細(xì)菌及真核微生物都發(fā)現(xiàn)有它們的噬菌體存在；它們對海洋環(huán)境中的細(xì)菌的群落、類型和數(shù)量等的變化產(chǎn)生重要的影響。此外，噬菌體作為指示微生物，在監(jiān)測海洋環(huán)境，指示污染程度等方面的研究也有了一些進(jìn)展活。

5 噬菌體研究中存在的問題

5.1 菌體的宿主范圍窄 噬菌體具有高度的特異性，所以治療性噬菌體往往只對某一型或幾型的細(xì)菌有效，而對其他菌株裂解效果很弱或無治療作用，使其應(yīng)用的范圍受到很大的限制

5.2 噬菌體的制備要求高 早期的噬菌體是由宿主菌的粗裂解物中分離的，其中混有很多雜質(zhì)，包括細(xì)菌內(nèi)毒素，這些雜質(zhì)對噬菌體的治療效果產(chǎn)生負(fù)面影響

5.3 噬菌體的穩(wěn)定性差 在早期的噬菌體制劑中常需加入汞制劑或氧化劑以確保無菌但經(jīng)過處理以后，噬菌體的活性有不同程度的降低，治療效果也受影響

5.4 噬菌體作用方式缺乏了解 許多研究者因為無法區(qū)分溫和性噬菌體和毒性噬菌體，而錯用溫和性的作為治療之用，導(dǎo)致治療效果很差甚至無效

5.5 噬菌體制劑使用條件要求過高 有一種名為Enterophagos噬菌體制劑，只對濕疹蕁麻疹和皰疹有效，若條件不符時幾乎無效解決問題的方法：（1）優(yōu)選菌株，并選用高裂解性、高特異性的噬菌體用以克服噬菌體裂解譜窄的問題。（2）通過純化噬菌體制劑來降低毒素水平。（3）為減少機體免疫系統(tǒng)對噬菌體的吞噬，延長噬菌體在體內(nèi)發(fā)揮作用的時間，可采用連續(xù)傳代并選擇發(fā)生突變后能在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)存活的噬菌體用于治療。

6 展望

隨著對噬菌體生物學(xué)特性研究的不斷深入和拓寬，單一運用噬菌體治療疾病存在的不足勢必會被解決。在當(dāng)前科學(xué)領(lǐng)域多學(xué)科綜合的大趨勢下，基于噬菌體的多學(xué)科綜合開發(fā)新技術(shù)或設(shè)備也一定會引起科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注，如與生物芯片聯(lián)合應(yīng)用的技術(shù)將會日漸成熟。噬菌體諸多性質(zhì)將使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。在未來幾年里，將會有越來越多的噬菌體新藥上市。然而根據(jù)進(jìn)化理論，不管是哪種藥物，病原菌總會對其產(chǎn)生耐藥性，而這種耐藥性的出現(xiàn)與密度感應(yīng)現(xiàn)象有很大的關(guān)系，故而開發(fā)阻止細(xì)菌間信息傳遞的藥物以抑制耐藥菌株產(chǎn)生也會成為新藥研究的熱點。

[1] 藺紅平. 利用噬菌體進(jìn)行生物防治的研究進(jìn)展[J]. 湛江師范學(xué)院學(xué)報. 2007, 6(28): 3.

[2] 朱育瑋, 李玉保, 王守榮等. 噬菌體及其治療細(xì)菌感染的研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2015.

[3] 蘇勝兵,馬紅霞,徐鳳宇.噬菌體在細(xì)菌性疾病診斷和治療中的應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué). 2011,41(5): 546-550

[4] 魯會軍，韓文瑜，雷連成.治療性噬菌體制劑研究進(jìn)展[J]. 中國獸藥雜志. 2002, 36(6): 39-41,

[5] ElizabethKutter. Phage therapy: bacteriophagesas antibiotics. Evergreen States College[J/OL]. 1997.

[6] Lorch, A. Bacteriophages: analternativetoantibiotics [EB/OL]. Biotechnology and Development Monitor. 1999, 39: 14-17.

[7] PayneRJ. andPhilD.J.Phagetherapy:thepeculiarkineticsofselfreplicating pharmaceuticals[J]. ClinPharmacolTher, Sep. 2000,68(3):225-230.

[8] Results of bacteriophages treatment of suppurative bacterial infection [EB/OL]. Archivum Immunologiae et Therapeae Experementalis, 1983, 31, 267.

[9] 李萌, 王靜雪, 林洪. 噬菌體檢測食源性致病菌的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(23): 439-446.

[10] Sergueev K V, He Y, Borschel R H,et al.Rapid and sensitive detection ofYersinia pestisusing amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by rea-l time PCR[J]. PLoS ONE, 2010, 5(6): e11337.

[11] 彭麗, 沈小兵, 羅永艾等. 結(jié)核分枝桿菌噬菌體試劑盒的研制與初步評價[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2010, 35(3): 389-392.

[12] Peng Li, Shen Xiao-bing, LUO Yong-ai, et al.A study and evaluation of bacteriophage.s utilization in rapid detection of Microbacterium tuberculosis[J]. Journal of Chongqing Medical University, 2010, 35(3): 389-392.(in Chinese)

[13] 王慶, 徐東芳. 噬菌體生物擴增法檢測結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性研究[J]. 中國防癆雜志, 2011, 33(1): 43-46.

[14] 李灝. 畜禽腸道致病菌及其噬菌體的分離及特性研究[D]. 濟南:山東大學(xué), 2014.

[15] 司樨東. 噬菌體學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1996.

[16] 甘莉萍, 劉渠, 陳應(yīng)堅等. 脈沖凝膠電泳分型在傷寒暴發(fā)中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2006, 33(1): 63-651.

[17] 謝明杰, 李太武. 噬菌體脫毒機理的研究?[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 1999, 11(2): 118-1201.

[18] 李太武, 相建海, 劉瑞玉等. 噬菌體防治皺紋盤皰膿皰病的研究[J]. 海洋與湖沼, 1999, 30(4): 374-3801.

[19] 寧淑香, 聶麗平, 陸敏. 河流弧菌-II(Vibrio fluvialis-II)噬菌體-VP8的分離與研究[J]. 微生物學(xué)雜志, 2000, 20(1): 20-311.

[20] 呂欣. 噬菌體在細(xì)菌性感染治療中的應(yīng)用及展望[J]. 國外醫(yī)學(xué)病毒學(xué)分冊, 2002, 8(6): 190-1921.

[21] 徐焰. 噬菌體溶菌機制研究進(jìn)展[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2003, 32(1): 106-1081.

[22] 寧淑香, 聶麗平, 鄒俠. 大連近海河流弧菌ò噬菌體的分離與研究[J]. 微生物學(xué)通報, 2002, 29(6): 20-231.

[23] 張克斌. 銅綠假單胞菌噬菌體的分離鑒定及其基因組學(xué)研究[D].重慶: 第三軍醫(yī)大學(xué), 2011.

[25] Alisky J, Iczkowski K,Rapopoet A, et al. Bacteriophages show promise as antimicrobial agents[J]. Infect, 1998, 36(1)5-151.

[25] 鄭志學(xué), 龐仲華, 司穉東等. 綠膿桿菌噬菌體用于呼吸道疾病防治的研究[J]. 中華結(jié)核和呼吸系統(tǒng)疾病雜志, 1978, 28(2): 94-95.

S852.61+3

A

1007-1733(2017)05-0063-03

2017–01–09）