基于危害及可操作性分析的設計空間法優化紅參醇提工藝

趙芳+龔行楚+瞿海斌

[摘要]基于質量源于設計理念，采用危害及可操作性分析法與設計空間法對紅參醇提工藝進行優化。首先采用危害及可操作性分析法結合實際生產對醇提工藝進行風險評估，確定乙醇濃度、醇料比和提取時間為關鍵工藝參數，然后采用BoxBehnken設計法建立關鍵工藝參數和工藝評價指標間的數學模型，在此基礎上計算設計空間，最終選取的操作空間為：醇濃度903%～907%，醇料比25～31 mL·g-1，每次提取時間124～130 min。結果表明，該研究方法能降低紅參醇提工藝各參數的風險水平，為提高工藝控制水平提供了新思路。

[關鍵詞]紅參；提取；質量源于設計；危害及可操作性分析；設計空間

[Abstract]Quality by design principle was used as a guideline in this study to optimize ethanol reflux extraction of red ginseng Firstly， hazard and operability analysis（HAZOP） was used as a risk assessment tool to evaluate the hazard degree of process parametersEthanol concentration， the ratio of alcohol and herbal material （A/M ratio）， and extraction time were identified as the critical process parameters（CPPs） according to HAZOP methodSecondly， BoxBehnken experimental design was applied to establish theregression models between CPPs and the process indices Finally， the design space was calculated The recommended operation space of parametersis as follows：alcohol concentration of 903%907%， A/M ratio of 2531 mL·g-1 and extraction time of 124130 min The study shows that the design space approach combined with the risk assessment using HAZOP has the potential to reduce the risk of red ginseng extraction process， which might ultimately improve the process control

[Key words]red ginseng； extraction； quality by design； hazard and operability analysis； design space

近年來，在美國FDA倡導下，質量源于設計（quality by design，QbD）理念在國際制藥領域產品和工藝的開發和優化中得到大力推行[1]。QbD理念基于質量風險管理技術，強調理解藥品及其生產過程，重視生產過程控制，建立能夠確保產品質量的生產過程輸入（如物料性質）和過程參數組合的范圍，即設計空間。俞翔等較早將QbD理念應用于中藥生產過程質量控制[2]，有助于理解中藥生產工藝，提高質量控制水平。隨后多位研究者報道了利用風險分析和試驗設計等手段在中藥提取[35]、醇沉[67]、水沉[8]、色譜[9]、脫色[10]等工藝環節建立設計空間的案例。

危害及可操作性分析（hazard and operability analysis，HAZOP）是常用的風險分析方法[11]。HAZOP法假設生產中的風險事件是由設計或操作產生了偏差而導致的，已在石油、化工、食品和醫藥等領域得到了廣泛應用[12]。將HAZOP應用于辨識中藥生產過程中的潛在危害參數（potential hazardous parameter，PHP），有助于提升中藥生產過程的質控水平。

參麥注射液是在中醫古方“生脈散”基礎上研制的中藥制劑，在臨床上主要用于心力衰竭、心律不齊等心血管疾病的治療，另外也常用作抗腫瘤藥的輔助用藥，由紅參和麥冬2味藥材經醇提水沉工藝制得[1314]。本研究以紅參乙醇回流提取為例，采用HAZOP法對工藝參數進行風險評估，辨識高風險的PHP，將可控性強的PHP作為關鍵工藝參數（critical process parameters，CPP）。在此基礎上采用試驗設計方法建立CPP與評價指標之間的定量模型，構建提取工藝設計空間并進行驗證，達到降低工藝風險的目的。

1材料

分析天平（AB204N，XS105，梅特勒托利多上海有限公司）、電子天平（SE6001，奧豪斯儀器有限公司）、超純水機（MilliQ，美國Millipore公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG9123A，上海精宏實驗設備有限公司）、高效液相色譜儀（Agilent 1100型，Agilent科技有限公司，配四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、ELSD檢測器、ChemStation工作站）、恒溫槽（THD1008W，寧波天恒儀器廠）、紫外可見分光光度計（Cary60，Agilent公司）。

紅參（產地吉林，批號20141014，大理藥業股份有限公司提供）。果糖對照品[批號B1625030，阿拉丁試劑（上海）有限公司]，蔗糖對照品[批號WXBB0906V，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司]，麥芽糖對照品[批號SLBL5443V，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司]。人參皂苷Rg1對照品（批號140729），人參皂苷Re對照品（批號140721），人參皂苷Rb1對照品（批號140723），人參皂苷Rc對照品（批號160507），人參皂苷Rb2對照品（批號160323），人參皂苷Rd對照品（批號140719），均購自上海融禾醫藥科技有限公司；人參皂苷Rf對照品由吉林大學陳燕萍教授提供。無水乙醇購自上海凌峰化學試劑有限公司，去離子水由水純化系統（MilliQ，Milford公司）制備，色譜純乙腈購自Merck公司。

2方法

21HAZOP風險評估

根據項目風險可接受標準的要求，對紅參的乙醇回流提取所使用的工藝參數進行系統評估。HAZOP法進行風險分析的步驟包括[15]： ①組成由研究人員、車間技術人員和操作人員形成的評價小組，確定分析對象；②整理出工藝所涉及的所有參數，分析存在的危害及程度，辨識出PHP，當易控時將其作為CPP；③選擇引導詞（guidewords），如多余、過大、過小、部分、其他等，對相應參數的偏差進行描述；④按關鍵詞逐一分析每個操作步驟可能產生的偏差，確認實際生產中所存在的可能產生偏的的參數；⑤參照現有的生產過程，分析可能造成的結果，包括設備損壞、質量波動、經濟損失等。

22樣品制備

準確稱取30 g紅參飲片，置于玻璃夾套提取罐中，加入一定量乙醇，加熱回流提取一定時間，濾過，收集濾液。相同條件下，1份飲片共回流提取6次，所用單次提取時間及溶劑均相同，合并濾液，密封后常溫放置。

23試驗設計

231工藝評價指標的確定選擇單位藥材中的總糖提出量，總固體提出量，以及人參皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Rc，Rb2，Rd等7種皂苷的提出量，共計9個質量參數為工藝評價指標。

232BoxBehnken設計采用BoxBehnken設計方法研究紅參乙醇回流提取PHP和工藝評價指標之間的定量關系。工藝參數水平范圍見表1，工藝設計見表2。

24分析方法

總固體含量的測定采用干燥失重法[16]，計算公式如下。

趙芳等：基于危害及可操作性分析的設計空間法優化紅參醇提工藝總固體質量分數=恒重后固體質量1樣品質量（1）

7個人參皂苷濃度的測定采用高效液相色譜與紫外檢測器聯用法（HPLCUV）[17]。分析條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB C18柱（46 mm×250 mm，5 μm）；以005%磷酸水為流動相A，以005%磷酸乙腈為流動相B，梯度洗脫（0 min，18%B；0～26 min，18%～20%B；26～35 min，20%～30%B；35～50 min，30%～32%B；50～57 min，32%～33%B；57～65 min，33%～40%B）；流速15 mL·min-1；檢測波長203 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

紅參醇提液中含有的糖類主要為果糖、蔗糖及麥芽糖[1819]，本研究以果糖濃度、蔗糖濃度及麥芽糖濃度之和來表征提取液中總糖濃度。糖類濃度的測定采用高效液相色譜與蒸發光散射檢測器聯用法（HPLCELSD）[19]，分析條件：色譜柱為Grace Prevail Carbonhydrate ES （46 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈水（70∶30）；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。ELSD檢測器條件為：氮氣流量20 L·min-1；漂移管溫度100 ℃；增益20；碰撞器關。

25數據處理

單位藥材的總固體提出量、總糖提出量及7個人參皂苷的提出量的計算如下。

總固體提出量=提取液固含量×提取液總質量1藥材用量（2）

總糖提出量=提取液總糖濃度×提取液總體積1藥材用量（3）

人參皂苷提出量=提取液中人參皂苷濃度×提取液總體積1藥材用量（4）

為描述紅參醇提關鍵工藝參數和工藝關鍵評價指標的關系，采用多元線性回歸法建立數學模型。數學模型的基本形式如下。

Y=a0+∑3i=1aiXi+∑3i=1aiiX2i+∑2i=1∑3j=i+1aijXiXj（5）

其中，a0為常數，ai，aii與aij表示各項回歸系數，Y表示紅參醇提工藝評價指標，Xi為關鍵工藝參數。在此基礎上采用MODDE軟件提供的Monte Carlo方法計算獲得設計空間。參數設置：分辨率為64，每個點計算模擬次數為3萬次，每個工藝指標以2%作為失敗概率的最大值，小于等于該概率的工藝參數組合屬于設計空間之內。

所有計算由Microsoft Office Excel 2013 （Microsoft，USA）和MODDE Pro 1101（MKS Umetrics，Sweden）軟件完成。

3結果

31HAZOP風險分析結果

利用魚刺圖分析可以找到影響提取過程的工藝參數和設備監測參數，見圖1。這些參數主要涉及5個方面：藥材、環境因素、設備、溶劑和提取工藝操作條件HAZOP風險分析結果見表3。

表3所列的中、高風險的潛在危害參數如控制不當，單位紅參飲片對應的溶劑量、溶劑醇含量、提取時間等參數可能出現偏差，進而導致不同批次的提取液某些化學組分的提出量產生差異。綜上所述，HAZOP分析結果符合實際生產情況，本研究將溶劑醇含量、單次提取時間、醇料比設定為需要進一步通過工藝設計來優化的CPP。

32關鍵工藝參數和工藝評價指標之間回歸模型的建立

根據優化要求，需要建立CPP的設計空間，在此基礎上給出操作空間。本研究采用BoxBehnken法進行工藝設計，結果見表4。1 g紅參藥材能提出970～3155 mg的總固體；糖類提出量為573～1983 mg·g-1生藥。提出物中，總糖質量約占總固體質量的50%～70%，7個人參皂苷的總質量約占總固體質量的5%～8%。其中，人參皂苷Rb1提出量最高，為2039～5137 mg·g-1生藥，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rc次之，人參皂苷Rd的提出量最少。

采用MODDE軟件建立多元線性回歸模型，經模型及系數顯著性分析，得到模型的回歸系數、R2以及調整R2見表5。

大部分模型的調整R2大于08，提取量較少的Rc和Rd，其調整R2接近08，說明模型能解釋大部分變異。對所有指標，X1的系數均P<0001，說明乙醇濃度對醇提工藝影響顯著。對大部分指標，X2的系數均P<0001，說明提取時間對醇提工藝的影響也較為顯著。X3僅對總固體提出量與總糖提出量影響顯著，相應系數均P<01。

在工藝參數的設計范圍內，從所有人參皂苷提出量的回歸模型可以看出，X1和X12系數均為負值，X2系數均為正值，說明隨著醇濃度的降低和單次提取時間的延長，人參皂苷提出量均變大；X3在人參皂苷提出量模型中無統計學意義，這說明在固定醇濃度和提取時間時，人參皂苷提出量不受醇料比變化而變化。從總固體和總糖提出量的回歸模型可以看出，X1系數為負值，X2與X3的系數為正值，說明隨著醇濃度的降低、提取時間的延長及醇料比的變大，總固體和總糖的提出量變大。

以上規律為紅參醇提工藝參數優化提供了思路：在精準控制醇濃度、采取較長的提取時間的情況下，使用較低的醇料比有利于在提取工藝中獲得更多的人參皂苷，同時可以盡可能減少糖類的提出。

33設計空間的計算和驗證

331工藝評價指標范圍設置人參皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Rc，Rb2，Rd等作為參麥注射液的有效成分，具有抗氧化，抗衰老，抗腫瘤等生物活性[13]，

所以希望在生產過程的各個環節中保證其有盡可能大的轉移率。果糖、蔗糖及麥芽糖在制劑時會部分轉化生成5羥甲基糠醛，可能對人體橫紋肌和內臟有損害[20]，所以將這幾種糖類作為需要限制的成分。在工藝參數優化時，為進一步提升工藝品質，設定以下提取工藝評價指標標準：對單位藥材的人參皂苷提出量不設上限，對總糖提出量設置上限，對總固體提出量設置上下限，見表6。據此標準，采用32項所得回歸模型，用MODDE軟件計算得到設計空間。

332設計空間根據表6計算得到的不同醇料比下的概率設計空間見圖2。圖片中數字為工藝參數落在相應區域時，工藝評價指標未能達標的概率。

a醇料比=25 mL·g-1；b醇料比=28 mL·g-1 ；c醇料比=31 mL·g-1；顏色由綠至紅的漸變表示相應工藝條件下，響應值不符合要求的概率（失敗概率）由1%逐漸增大。

在工藝指標達標概率均≥98%的設計空間范圍內選擇最合適的操作空間。結合32項中提出的關鍵工藝參數對紅參醇提工藝指標的影響規律，最終選擇的操作空間為：乙醇濃度903%～907%，醇料比25～31 mL·g-1，每次提取時間124～130 min。

333設計空間的驗證為驗證設計空間的準確性，在設計空間內、外取點進行驗證。具體驗證點及驗證結果見表7。從驗證結果可知，預測值和實測值接近，說明所建模型有較好的預測性能；設計空間內驗證點所得提取液指標均達標，而設計空間外驗證點所得提取液中總固體提出量及個別人參皂苷提出量未達到最低標準，說明在設計空間內操作能保證較好的工藝品質。

4討論

本研究以QbD理念為指導原則，以參麥注射液生產過程中紅參的乙醇提取工藝優化為例展開研究。首先通過HAZOP法分析紅參醇提工藝中涉及的各個工藝參數，確定乙醇濃度、醇料比及提取時間為關鍵工藝參數；接著選取總糖提出量、總固體提出量、7個在參麥注射液中含量較高的人參皂苷提出量為工藝評價指標。然后采用BoxBehnken設計法建立關鍵工藝參數和工藝評價指標間的數學模型，最后計算獲得設計空間。根據計算結果，參麥注射液生產過程中紅參醇提工藝的推薦操作空間為903%～907%乙醇，醇料比在25～31 mL·g-1，每次提取時間124～130 min。總體來看，選擇較低的醇料比和醇濃度，以及較長的提取時間，有利于獲得人參皂苷含量較高而糖類含量較低的紅參提取液。

HAZOP法相比其他基于理論分析和文獻調研的風險分析方法，對中藥的生產過程優化有更好的適用性和實用性。通過理論分析與科學設計，基于HAZOP法建立的設計空間能夠將人工經驗轉化為過程知識和標準操作規范。在研究過程中，HAZOP法有助于提高設計水平，避免無效的設計因子，使得后續設計與實際生產的契合度更高，從而有效地節約研究成本。

此外，從本研究對參麥注射液生產過程中紅參醇提工藝的HAZOP風險評估結果來看，篩選出的中、高風險危害參數與實際生產中重點控制的工藝參數較為一致，說明我國藥品標準對參麥注射液中紅參提取工藝的規定是較為科學的。在工業生產中，企業需要提高對各潛在高危害工藝參數的控制水平，如保證乙醇配制工序和計量工具的精度、提取罐設備等良好運行等，進而提高提取工藝質控水平。

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