Keap1、Nrf2和HO—1在大鼠應激性胃潰瘍中的表達

黃攀++陸瀚文++周崢嶸++宋廣浩++安珂++張莊 丁威

摘要：探討Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相關因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）/血紅素氧合酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）信號通路在應激性胃潰瘍發生及發展中的作用。建立大鼠水浸束縛應激性（water immersion and restraint stress，WRS）胃潰瘍模型，按Guth[JP2]標準計算潰瘍指數（ulcer index，UI），應用免疫組織化學檢測Keap1、Nrf2、HO-1在胃黏膜組織中的定位和表達情況。結果表明，WRS處理7 h后，大鼠胃黏膜出現明顯的點線狀出血；WRS處理前后，Keap1、Nrf2、HO-1蛋白均主要定位于大鼠胃底腺細胞胞質中，其中Nrf2在潰瘍周圍胃底腺細胞胞核中也有表達；WRS處理7 h后，Keap1表達量顯著降低（P<0.05），于7 d后恢復至正常水平，而HO-1表達量顯著升高（P<0.05），于3 d后恢復至正常水平；Nrf2恢復3 d后表達量顯著升高（P<0.05），隨后出現下降。WRS處理后，Keap1、Nrf2、HO-1在大鼠胃黏膜中的定位和表達量均出現變化，提示Keap1/Nrf2/HO-1信號通路可能在應激性胃潰瘍的發生及發展過程中發揮了一定抗應激作用。

關鍵詞：應激性胃潰瘍；Keap-1；Nrf2；HO-1；大鼠

中圖分類號： S858.91文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0280-03

收稿日期：2015-11-02

基金項目：國家自然科學基金（編號：81300287）；江蘇省自然科學基金（編號：BK2011499、BK20140541）；江蘇大學高級人才項目（編號：12JDG084）。

作者簡介：黃攀（1984—），男，安徽安慶人，博士，講師，主要從事消化道潰瘍病研究。E-mail：phuang@ujs.edu.cn。

通信作者：丁威，博士，副教授，主要從事動物繁殖育種研究。E-mail：qishi6598@126.com。

應激性胃潰瘍是動物受到環境應激后，交感神經系統（SNS）興奮性升高，血管收縮，引起胃黏膜缺血、缺氧、抵抗力下降，從而產生的急性出血性損傷[1]。應激性胃潰瘍的發生及發展與細胞氧化應激密切相關，應激后下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）敏感性升高，引起胃酸、胃蛋白酶、胃泌素分泌增加[2-3]；同時，皮質醇與兒茶酚胺的釋放可誘導氧自由基的產生，導致細胞膜內脂質過氧化物的生成，從而引起氧化應激[4]。Keap1/Nrf2/HO-1信號通路在細胞抗氧化損傷和炎癥損傷過程中發揮重要作用[5]。生理狀態下，Nrf2與胞漿伴侶分子蛋白Keap1偶聯并被錨定在胞漿中，Nrf2處于相對失活狀態；當細胞暴露于氧自由基時，Keap1的構象發生改變，Nrf2從二聚體上解離并轉移進入細胞核，與核內抗氧化應答元件（antioxidant responsive element，ARE）結合，啟動ARE調控的下游抗氧化基因HO-1等的表達，清除多余的氧自由基，從而發揮抗應激作用[6]。王菲等研究發現，Keap1和Nrf2在熱應激造成的大鼠肝臟損傷中發揮抗應激作用[7]。沈錫中研究發現，HO-1在乙酸誘導的大鼠胃潰瘍中表達明顯增強，對胃黏膜具有一定保護作用[8]。在胃潰瘍的發生及發展過程中，HO-1是否受上游Keap1/Nrf2/ARE信號通路的調控有待驗證。通過研究Keap1/Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白在大鼠應激型胃潰瘍中的表達情況，初步探討其在應激性胃潰瘍中可能發揮的作用。

1材料與方法

1.1試劑

Keap1抗體、Nrf2抗體、HO-1抗體均購自大連寶生物公司，ABC試劑盒購自武漢博士德生物公司，DAB購自 Sigma公司（美國），動物切片石蠟（熔點為60～62 ℃）、多聚甲醛購自上海凌鋒化學試劑有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2試驗動物處理

采用28只9～11周齡、體質量200～220 g的雄性SD大鼠作為試驗動物，購自江蘇大學試驗動物中心。試驗前對大鼠饑餓處理24 h，然后采取束縛處理并浸泡于（20±2）℃的水中，水位達到大鼠劍突部[9]。分別于應激后7 h、恢復3 d、恢復7 d時采樣。采用乙醚麻醉，頸椎脫臼致死。

1.3潰瘍指數的測定

剖腹將胃取出，結扎賁門和幽門，從腺胃部注入10 mL 1%多聚甲醛，并將全胃放入1%多聚甲醛溶液中浸泡 10 min；沿胃大彎將胃剪開，用生理鹽水輕輕沖洗胃黏膜面，按Guth標準評估胃黏膜損傷UI，并按以下標準累計積分[10]。按黏膜潰瘍或糜爛長度（mm）計算，斑點狀糜爛為1分；糜爛長度不足1 mm為2分，介于1～2 mm為3分，2～4 mm為4分，超過4 mm為5分；糜爛寬度超過1 mm則分值加倍。全胃得分之和為胃潰瘍指數。

1.4樣品處理與免疫組織化學

選取病變及與其交界處胃壁全層的胃組織，采用石蠟切片法制作成厚度為7 μm的切片，將切片進行免疫組織化學染色，觀察胃黏膜組織HO-1、Keap1、Nrf2的定位與表達。

1.5免疫組織化學陽性結果的判定

Keap1、Nrf2、HO-1蛋白陽性表達時，經免疫組織化學染色著色呈棕褐色。對上述結果采用雙評分半定量法進行統計，在顯微鏡下隨機觀察5個高倍鏡視野，每個視野計數的細胞≥1 000個，并統計陽性細胞的平均百分比，以此作為評分標準。具體評分方法為：無陽性細胞為0分，陽性細胞占0～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。以染色程度作為評分標準，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將以上2種評分結果相加，作為該切片的表達強弱得分。每只大鼠選取10張切片，計算每組的平均得分。整個計數及評分過程均由2位經驗豐富的病理醫師協助完成。

1.6統計學分析

所有數據均以“平均值±標準誤”（x[TX-*5]±s）表示，所有試驗均重復4次以上。采用SPSS 17.0統計軟件對試驗數據進行處理，經單因素方差分析（ANOVA），差異顯著性檢驗采用Turkey檢驗法進行多重比較。

2結果與分析

2.1WRS處理對大鼠胃黏膜UI的影響

由圖1可知，WRS處理7 h后，大鼠胃黏膜出現點線狀潰瘍出血和少量血凝塊，UI為39.7±6.8；恢復3 d時UI為 30.6±6.1，與WRS 7 h組相比差異不顯著（P>0.05）；恢復 7 d 時UI為10.4±5.0，顯著低于WRS 7 h組和恢復3 d組（P<0.05）。

2.2免疫組織化學檢測Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的定位

由圖2可知，WRS處理前后，Keap1（圖2-A）、Nrf2（圖2-B）、HO-1（圖2-C）3種蛋白均主要定位于大鼠胃底腺細胞胞質中，其中Nrf2在潰瘍周圍胃底腺細胞胞核中也有表達。

2.3Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的表達水平

[CM（24]由圖3可知，WRS處理7[KG*3]h后，Keap1表達量顯著降低[CM）]

[FK（W12][TPHP1.tif]

[FK（W19][TPHP2.tif]

（P<0.05），7 d后恢復至正常水平。WRS處理7 h后，Nrf2表達量無顯著變化，但恢復3 d后其表達量顯著升高（P<0.05）；與恢復3 d組相比，恢復7 d時Nrf2表達量出現下降（P<0.05），但仍顯著高于正常水平（P<0.05）。WRS處理7 h后，HO-1表達量顯著升高（P<0.05），3 d后恢復至正常水平。

[TPHP3.tif]

3結論與討論

WRS處理大鼠被廣泛應用于應激性胃潰瘍病理機制的研究，具有簡單、高效、重復性高等特點，是理想的試驗動物模型。本試驗中，WRS處理7 h后，大鼠胃黏膜出現明顯的潰瘍病變，表明應激性胃潰瘍模型建立成功。

動物受到環境應激后，SNS、HPA敏感性升高，腎上腺素、糖皮質激素、兒茶酚胺等激素的分泌增加，誘導氧自由基大量產生，導致細胞膜內脂質過氧化物的生成，引起氧化應激。大量研究表明，Keap1/Nrf2/HO-1信號通路在細胞抗氧化損傷和炎癥損傷等過程中發揮重要作用[5]。其中，核轉錄因子Nrf2屬于CNC-bZIP（cap‘ncollar subfamily of basic leucine-zipper），即CNC亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族，能夠誘導一系列抗氧化劑保護蛋白的編碼，參與調節抗氧化應激反應，是CNC家族成員中最強的轉錄因子[11]。大量研究表明Nrf2與多種疾病的發生有關[11-15]。很多因素可影響Nrf2的表達。Keap1是一種E3泛素連接酶，在胞漿中錨定于肌動蛋白，可調節Nrf2的泛素化過程，是氧化應激反應的主調節器[13]。生理狀態下，Nrf2與Keap1偶聯被錨定在胞漿中，Nrf2被泛素化修飾并快速降解，從而維持細胞基礎的氧化還原平衡；當細胞暴露于氧自由基時，Keap1的構象發生改變，Nrf2從二聚體上解離并轉移進入細胞核，調控下游抗氧化基因HO-1等表達，清除多余的氧自由基，從而發揮抗應激作用[6，13]。通過免疫組織化學檢測發現，WRS處理前后，Keap1和Nrf2均主要定位于大鼠胃底腺細胞胞質中，其中Nrf2在胃潰瘍組織周圍胃底腺細胞胞核中也有表達。蛋白表達半定量分析發現，WRS處理7 h后，Keap1表達量明顯下降，Nrf2在恢復3 d后表達量顯著升高。提示WRS處理可能導致大鼠胃底腺細胞胞質中的Nrf2從二聚體解離，并轉移進入細胞核，從而起到了抗應激作用。

HO-1為誘導性血紅素加氧酶，別稱熱體克蛋白32，很多誘導因素均可引起其活性及蛋白量增加。已有研究證實，HO-1作為一種應激蛋白，在應激和疾病條件下對消化道具有抗炎、抗組織損傷、抗氧化、保護細胞黏膜、調節胃腸運動等積極作用。目前已從動物和人的組織器官中分離純化出3種血紅素氧合酶（HO）的同工酶，HO-1為誘導型，HO-2、HO-3 為結構型[16]。生理狀態下，消化道中的HO同工酶主要為HO-2，而HO-1在腸組織中不表達，僅在缺血、缺氧等刺激下才開始分泌HO-1。在消化道疾病中，HO-1的水平增加，發揮抗炎、抗氧化等細胞保護作用[17]。沈錫中在乙酸誘導的大鼠胃潰瘍模型中發現，HO-1蛋白定位于胃黏膜細胞中，胃潰瘍大鼠的胃黏膜HO-1基因表達水平顯著高于正常大鼠[8]。本試驗通過免疫組織化學檢測發現，WRS處理前后，HO-1均主要定位于大鼠胃底腺細胞胞質中；蛋白表達半定量分析發現，WRS處理7 h后，HO-1表達量出現明顯升高的現象。提示應激性胃潰瘍發生后，HO-1可能參與了胃黏膜抗損傷機制。

在應激性胃潰瘍的發生及發展過程中，Keap1、Nrf2、HO-1出現了表達量和蛋白定位的改變，表明這3種蛋白可能均參與了胃黏膜的抗氧化損傷機制。由于調控Nrf2和 HO-1的信號通路非常多，Keap1/Nrf2/HO-1信號通路在應激性胃潰瘍中的作用機制有待進一步驗證。

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