細胞類固醇合成酶的影響

趙曉光++李厚忠++孟娜娜++王利強++楊永濤++杜美超++張羽飛

二甲磺酸乙烷對成年大鼠睪丸間質不同時間點

[摘要] 目的 研究二甲磺酸乙烷（EDS）注射對雄性大鼠睪丸間質細胞類固醇關鍵合成酶表達的影響，并進一步了解EDS對大鼠睪丸間質細胞類固醇關鍵合成酶可能的調(diào)節(jié)機制。 方法 將25只90 d雄性SD大鼠隨機分為兩組，對照組（0 d，n = 5）一次性腹腔內(nèi)注射生理鹽水，EDS組（n = 20）一次性腹腔內(nèi)注射EDS 70 mg/kg體重。EDS組注射后7、21、35、90 d后取血清和睪丸組織，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清及睪丸中的睪酮水平，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡方法（Western blot）分別檢測睪酮合成相關基因類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、膽固醇側鏈裂解酶（P450scc）、3β-羥基類固醇脫氫酶1型（3β-HSD1）、P45017α-羥化酶1（P450c17a1）、17β-羥基類固醇脫氫酶3型（17β-HSD3）mRNA和蛋白表達水平。 結果 與對照組比較，EDS處理7 d后，睪丸內(nèi)的睪丸間質細胞幾乎完全被破壞，導致睪酮水平急劇下降（P < 0.01），睪酮合成相關酶StAR、3βHSD、P450scc、P450c17、17β-HSD3的mRNA及蛋白表達水平均顯著下降（P < 0.01），而處理21、35 d后，上述相關酶mRNA及蛋白表達水平均有所回升（P < 0.01或P < 0.05），處理90 d后，上述相關酶基因及蛋白的表達水平已經(jīng)基本上恢復到與對照組相近的水平，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結論 EDS能夠特異性地破壞雄性SD大鼠睪丸組織中的睪丸間質細胞，EDS的此種效應對研究睪丸間質細胞缺失下睪丸功能的變化進而研究精子發(fā)生的內(nèi)分泌調(diào)控均有較大意義。

[關鍵詞] 睪丸間質細胞；二甲磺酸乙烷；睪酮；類固醇合成酶

[中圖分類號] R339.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0015-04

睪丸間質細胞（Leydig cell）是哺乳動物睪丸間質中的一種重要的內(nèi)分泌細胞，具有合成和分泌體內(nèi)超過90%睪酮的功能，對于雄性的生育能力及第二性征的維持至關重要，是男性體內(nèi)雄激素的最主要來源。Leydig的發(fā)育、數(shù)量及雄激素合成功能對男性的各個方面都具有決定性的影響[1]。二甲磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）作為一種細胞毒性烷化劑，在20世紀80年代即已證實可以選擇性地殺死成年大鼠睪丸中的Leydig細胞，被認為是研究Leydig細胞再生的候選藥物之一[2-3]。目前，國外采取EDS建立模型研究Leydig細胞再生及其相關研究的報道較多[4-7]，但國內(nèi)報道相對較少，因此，本研究通過觀察一次性腹腔注射EDS對成年大鼠Leydig細胞的作用，測定EDS對處理后不同時間點大鼠睪丸Leydig細胞類固醇關鍵合成酶類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶（P450scc）、3β-羥類固醇脫氫酶1（3β-HSD1）、P45017α-羥化酶1（P450c17a1）、17β-羥類固醇脫氫酶3（17β-HSD3）在轉錄水平和翻譯水平表達的影響，為利用EDS建立體內(nèi)Leydig細胞再生模型的建立提供基礎實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑儀器

90 d SPF級健康雄性SD大鼠，體重250～280 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK京2012-0001。主要試劑：EDS（純度>97%，洛克菲勒大學Renshan Ge教授惠贈）；睪酮酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；RNA提取試劑盒（美國Omega公司）；逆轉錄試劑盒（美國Promega公司）；SYBR Green試劑盒（美國Promega公司）；PCR引物（上海生物工程有限公司）；抗體（美國Abcam公司）。主要儀器：熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；臺式低溫高速離心機（德國Sigma公司）；超微量核酸蛋白測定儀（美國Thermo Fisher公司）；全自動酶標儀（美國Molecular Devices公司）等。

1.2 實驗方法

將25只實驗大鼠隨機分為兩組，對照組（0 d，n = 5）一次性腹腔內(nèi)注射生理鹽水，EDS組（n = 20）一次性腹腔內(nèi)注射EDS 70 mg/kg體重；EDS組注射后于第7、21、35、90天結束，于相應時間點固定時間處死大鼠（每組5只），采集血清和睪丸組織，用ELISA測定血清中及睪丸中的睪酮水平，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡方法（Western blot）分別檢測睪丸組織內(nèi)睪酮合成相關基因StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1、17β-HSD3基因和蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

本文數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，組間兩兩比較采用Dunnett檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EDS對大鼠血清及睪丸內(nèi)激素水平的影響

EDS處理7 d后，大鼠血清中及睪丸內(nèi)睪酮水平濃度急劇下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），21 d后，濃度均有所回升，到35 d，已經(jīng)分別恢復到對照組水平的71%和75%，到90 d，濃度均已經(jīng)基本上恢復與對照組相當?shù)乃剑ǚ謩e為109%和97%）。見圖1。

2.2 EDS暴露后對睪丸內(nèi)相關基因相對表達水平的影響

隨著EDS處理時間的延長，各基因的表達趨勢基本一致。EDS處理7 d，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1和17β-HSD3 mRNA水平較對照組急劇降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。而后隨著EDS處理時間的延長，濃度呈上升趨勢，處理21 d后，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1及17β-HSD3的表達分別回升24%、15%、61%、38%和60%（P < 0.01或P < 0.05），處理35 d后分別回升了43%、28%、80%、60%和77%（P < 0.01）（3β-HSD1、17β-HSD3表達差異無統(tǒng)計學意義），到處理90 d后，上述指標表達水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 EDS暴露后對睪丸內(nèi)相關蛋白表達的影響

EDS處理7 d，StAR、P450scc、3β-HSD1和17β-HSD3蛋白的表達水平較對照組急劇降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。而后隨著EDS處理時間的延長，各蛋白的表達量呈上升趨勢，到90 d，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。處理21 d后，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1及17β-HSD3的表達分別回升47%、80%、43%、55%和52%（P < 0.01）（P450scc表達差異無統(tǒng)計學意義），處理35 d后分別回升了72%、56%、80%、60%和76%（P < 0.01或P < 0.05）（P450scc表達差異無統(tǒng)計學意義），到處理90 d后，分別回升了79%、75%、80%、71%和80%，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

3 討論

Leydig細胞在其分化發(fā)育中有4個顯著不同的階段：睪丸間質干細胞（SLC）、睪丸間質祖細胞（PLC）、未成熟睪丸間質細胞（ILC）和成熟睪丸間質細胞（ALC）[8，15-16]。Leydig細胞合成和分泌的睪酮是一系列酶促反應，其主要依賴于StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1和17β-HSD3等關鍵酶的調(diào)控[9-10]。其中StAR主要參與類固醇合成的早期調(diào)節(jié)，被認為是睪酮合成起始限速步驟，P450scc被認為是睪酮合成的限速步驟，它主要是將轉入線粒體內(nèi)的膽固醇轉化為孕烯醇酮，并在3β-HSD1作用下形成孕酮，后者再經(jīng)p450c17a1進一步催化生成雄烯二酮，后者在17β-HSD的作用下，最終生成睪酮[11-13]。因此，Leydig細胞合成睪酮過程中的關鍵酶表達降低的直接結果必然是引起單個細胞合成睪酮的表達能力明顯降低，從而影響睪酮的合成和分泌[14-16]。EDS是具有Leydig細胞特異性“敲除”的化合物。

EDS可以暫時殺死成熟的Leydig細胞，其后伴隨是Leydig細胞再生的過程，這種再生過程與人類青春期Leydig細胞的分化過程相類似。馬學等[17]給予新生雄性SD大鼠腹腔注射EDS后，建立了“敲除”胚胎睪丸間質細胞（FLC）模型，并確定了EDS有效和安全的劑量，為深入研究FLC和ALC之間的關系做了很好的前期研究基礎。張磊等[18]研究表明大鼠和小鼠EDS處理的生精小管體外培養(yǎng)模型能夠很好地模擬SLC在體內(nèi)的發(fā)育分化過程，彌補了細胞和動物實驗在研究SLC發(fā)育分化中的不足，建立了一個非常有價值的研究模型，尤其是在篩選和評估不同外源物質對SLC分化發(fā)育的影響研究有重要的作用。筆者也在前期的研究中利用EDS建立了“敲除”Leydig細胞模型的實驗，研究了再生后的Leydig細胞的基因表達情況[19-20]，為后續(xù)研究Leydig細胞發(fā)育生物學奠定了基礎。

本研究利用EDS處理大鼠后，分別在第0、7、21、35、90天檢測血清中和睪丸內(nèi)睪酮水平，并用qRT-PCR和Western blot檢測了相應時間點類固醇合成關鍵酶StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17和17β-HSD3基因和蛋白表達水平。結果顯示，這些酶的轉錄和翻譯水平在EDS處理7 d時迅速下降，隨著處理時間的延長都呈回升趨勢，表達趨勢呈一致。表明，大鼠腹腔注射EDS 7 d后睪丸ALC被殺滅，但SLC仍然存在，逐漸增殖分化，Leydig細胞又會再生。結果與既往理論也不謀而合，即Leydig細胞的發(fā)育經(jīng)歷4個階段：干細胞（第0天）、祖細胞（第7天）、未成熟細胞（第21天）和成熟細胞（第90天）。

以上結果提示，EDS可以作為建立去除Leydig細胞模型的候選藥物，并且該模型也可以作為進一步深入研究Leydig細胞發(fā)育生物學研究的動物模型，同時該模型對研究Leydig細胞缺失，進而導致睪丸功能的變化以及精子發(fā)生的內(nèi)分泌調(diào)控均有較大意義。

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（收稿日期：2016-10-11 本文編輯：張瑜杰）