阿魏酸調節C—KIT/MITF蛋白表達影響黑素生成的實驗研究

李偉+王加志+曲巖+王興焱+陳景華

[摘要] 目的 探討不同濃度阿魏酸對UVB誘導的A375細胞黑素生成的影響及其作用機制。 方法 常規體外培養A375細胞，分為空白組、模型組、阿魏酸低濃度（10 μmol/L）組、阿魏酸高濃度（100 μmol/L）組和陽性對照組，除空白組外，各組均以UVB 20 mJ/cm2照射，阿魏酸高低濃度組加含阿魏酸的培養液、陽性對照組加入含熊果苷的培養液作用24 h，四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法測定細胞增殖；采用多巴氧化法研究酪氨酸酶活性的變化；比色法測定黑素含量，免疫印跡法測定C-KIT和MITF蛋白表達。 結果 與空白組比較，模型組細胞酪氨酸酶活性和黑素含量明顯增加，阿魏酸低、高濃度組和陽性對照組均可抑制UVB誘導的A375細胞酪氨酸酶活性增高和黑素生成，其機制可能是通過下調C-KIT和MITF蛋白表達而實現的。 結論 高濃度阿魏酸可明顯下調C-KIT/MITF蛋白表達，進而抑制酪氨酸酶活性和黑素生成。

[關鍵詞] 阿魏酸；C-KIT/MITF；黑變病；黑素合成

[中圖分類號] R96 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0028-04

瑞爾黑變病（Riehl's Melanosis）是一種以面頸部灰紫色或灰褐色色素沉著為主要表現的皮膚病[1]。本病在形態學上以色素失禁為主要表現[2]，嚴重影響患者的容貌，以成年人多見，女性多于男性。皮損主要常見于面頸部。紫外線是本病發生的重要誘因[3]。阿魏酸為苯丙烯酸類化合物，是中藥當歸的主要活性成分，分子量為194.18。有研究表明[4-5]，阿魏酸有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護角質形成細胞紫外線損傷等作用。體外研究發現[6-7]，阿魏酸在體外對蘑菇酪氨酸酶呈可逆性的競爭性抑制，而阿魏酸對UVB造成的黑素細胞色素生成作用的影響則未見報導。本研究在前期當歸水提液的抗色素作用工作基礎上[8]，通過探討干細胞因子受體（C-KIT）和小眼畸形轉錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MiTF）蛋白表量差異，分析活性成分阿魏酸對酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）活性和黑素生成的作用機制，為瑞爾黑變病等色素沉著性疾病的治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

阿魏酸標準品（0773-9910）購自中國藥品生物制品檢定所；人黑素瘤細胞（A375）購于武漢細胞典藏中心；DMEM培養基（Gibco公司）；胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）（BiLLab公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京中杉金橋有限公司）；熊果苷、左旋多巴（L-dopa）、TritonX-100、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司）；小眼畸形轉錄因子一抗（MITF D5G7V Rabbit mAb #12590），干細胞因子受體一抗（C-KIT D13A2 XPTM Rabbit mAb #3074），甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH抗體（Rabbit mAb #2118），辣根過氧化物酶標記抗兔二抗（#7074）以上抗體均購于Cell Signaling Technology USA。紫外照射儀，紫外線輻照計（北京師范大學光電儀器廠），電泳儀、轉膜儀（BIO-RAD USA），MK3型酶標儀（熱電上海儀器有限公司）。

1.2 細胞培養與受試藥

在A375細胞處于對數生長期時，經胰蛋白酶消化，1000 r/min離心5 min，DMEM培養液（含10%胎牛血清）重懸細胞，用紅細胞計數板進行計數。阿魏酸配成濃度為2.57 mmol/L的貯備液，通過培養液稀釋，最終得到濃度為100 μmol/L～0.01 nmol/L 8個濃度組，將分為空白對照組、模型組、阿魏酸低濃度、阿魏酸高濃度和陽性對照組5組，熊果苷為陽性對照藥。模型組和給藥組均用中波紫外線（UVB）20 mJ/cm2照射[9]，給藥組在照射后給予不同濃度藥物作用24 h。

1.3 MTT檢測A375細胞的增殖抑制率

將濃度為5.0×104個/mL的A375細胞接種在96孔板中，每孔200 μL，5%CO2，37℃培養12 h，棄培養液，陽性對照組加入含1.1 mmol/L熊果苷的培養基，實驗組分別加入含阿魏酸不同濃度的培養基，每孔200 μL，每組設6個復孔，繼續培養20 h。棄培養基，每孔加5 g/L的MTT 20 μL繼續培養4 h。培養結束后，棄培養液，每孔加入150 μL DMSO，37℃震蕩10 min，酶標儀490 nm測定吸光度值（A）。細胞增殖活性用A490值表示。

1.4黑素含量的測定

調整A375細胞濃度約為4.5×104個/mL接種在6孔板中，每孔2 mL，5%CO2，37℃培養12 h。陽性對照組加入1.1 mmol/L熊果苷，實驗組加入含各濃度阿魏酸的培養基，每孔2 mL，每組設6個復孔，繼續培養24 h，棄培養基，用PBS清洗2次，經胰酶消化后，加入2 mL DMEM培養基中止消化，吹打成細胞懸液，1500 r/min離心5 min，棄去上清液，然后加入1 mol/L NaOH的100 μL，37℃水浴1 h，再加入400 μL去離子水充分混勻后，吸取100 μL/孔加至96孔板，在490 nm波長測定各孔A值。黑素含量用A490值表示。

1.5 酪氨酸酶（TYR）活性

調整細胞數為1.5×104個/mL接種在96孔板中，每孔200 μL，5%CO2培養12 h。空白組不加細胞，只加培養液，陽性對照組加入1.1 mmol/L熊果苷，實驗組加入含阿魏酸各濃度的培養基，每組設6個復孔，每孔200 μL，繼續培養24 h，用PBS洗滌2次，每孔加1%Triton-X溶液100 μL，反復凍融使細胞充分裂解。加入0.5%L DOPA溶液50 μL/孔，37℃下反應3 h，490 nm波長處測定各孔A值。TYR活性A490值表示。

1.6 Western blot分析

收集不同濃度阿魏酸作用24 h后的A375細胞，置冰上用RIPA蛋白裂解液充分裂解，14 000 r/min離心15 min，小心收集上清，BCA法測定蛋白濃度。將各受試組總蛋白配成統一濃度后加入5X上樣緩沖液混勻，100℃水浴中加熱10 min，取50 μg總蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，電轉至PVDF膜（100 V，90 min），5%脫脂奶粉（1XTBST配制）室溫封閉1 h，一抗用MITF、C-KIT抗體（1∶1000）4℃孵育過夜，洗膜后用HRP標記的二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜后用ECL試劑室溫反應1 min，凝膠成像系統檢測，曝光時間10 s，共10張。內參為GAPDH。

1.7 統計學方法

采用統計軟件SPSS 19.0對數據進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測阿魏酸對A375細胞的增殖抑制率

與空白對照組比較，阿魏酸各濃度下對細胞增殖不產生抑制作用，10、100 μmol/L可以觀察到增殖作用趨勢，所以本研究組選擇這2個濃度作為后續實驗的使用濃度，將10 μmol/L濃度組命名為阿魏酸低濃度組，100 μmol/L濃度組命名為阿魏酸高濃度組。見圖1。

2.2 阿魏酸對TYR活性及黑素含量的影響

與空白對照組比較，UVB引起的黑素合成和TYR活性顯著升高（P < 0.01）；與模型組比較，阿魏酸各濃度組和陽性對照組均對其產生顯著的抑制作用，差異有高度統計學意義（P < 0.01），并呈一定的劑量依賴關系，阿魏酸低濃度組抑制作用弱于陽性對照組（P < 0.05），阿魏酸高濃度組與陽性對照組差異無統計學意義（P > 0.05）。

2.3 阿魏酸、UVB對C-KIT和MITF蛋白表達的影響

與空白對照組比較，UVB對MITF和C-KIT蛋白表達有促進作用，而陽性對照藥熊果苷和阿魏酸對MITF和C-KIT蛋白表達有顯著的抑制作用，呈一定的劑量依賴關系。見圖2。

3 討論

UVB的照射引起黑素生成、轉運和代謝異常與C-KIT/MITF/TYR通路調控異常關系密切[10-11]，C-KIT是表達于黑素細胞表面、具有酪氨酸激酶活性的Ⅲ型跨膜受體，屬于免疫球蛋白超家族，由原癌基因C-KIT編碼，其相對分子量為14 500。己發現瑞爾黑變病在發病前或是發病過程中出現C-KIT表達水平的異常[12]。MITF是SCF/Kit信號轉導途徑的下游分子，也是TYR等黑素生成重要分子轉錄調控的分子開關（molecular switchboard）[13-15]，在黑素細胞的發育、分化和功能等方面發揮著重要的作用，這也將成為色素障礙性皮膚病的主要作用靶點[16]。

熊果苷作為常用的脫色劑，有明顯的抑制酪氨酸酶活性，減少黑素生成的作用，但已有發生不良反應的報道[17]。為此有必要從中藥中尋找有調節黑色素作用又安全的化學物質。根據報道當歸及含當歸方劑有抑制酪氨酸酶活性的作用[18]，結合本課題組前期工作用基礎，本研究以A375細胞為研究對象，當歸活性成分阿魏酸為受試藥物進行研究。

本研究結果提示，UVB可誘導A375細胞酪氨酸酶活性升高，黑素生成量增加，在作用上則表現為上調C-KIT和MITF蛋白表達，兩者呈正相關。阿魏酸在10、100 μmol/L濃度均可降低A375細胞的酪氨酸酶活性并減少黑素生成，下調C-KIT和MITF蛋白表達，但高劑量組作用更明顯。體外研究顯示出阿魏酸有抑制酪氨酸酶活性的作用，在細胞實驗中，阿魏酸作用于膜受體還是被細胞內吞而接觸到酪氨酸酶而起作用尚不清楚，本研究所觀察到的抑制C-KIT和MITF蛋白表達可能是其抗色素沉著作用的機制之一。黑變病的病位在表皮、真皮層，在治療上口服藥物分布到皮膚的有效藥物濃度較低，經皮給藥是最佳方案。有研究報道[19]，阿魏酸分子型易透過皮膚，直接作用于病變部位，在充分闡釋其作用機制的基礎上，有望將阿魏酸開發成為功效型化妝品用于色素性皮膚病的預防或治療[20]。

[參考文獻]

[1] 孟慧敏，周成霞，李利.瑞爾黑變病病因與發病機制研究進展[J].中國生物美容，2009，（4）：60-63.

[2] 李桐，李利.里爾黑變病發病機制與治療研究進展[J].實用皮膚病學雜志，2015，8（6）：446-452.

[3] Scott G，Deng A，Rodriguez-Burford C，et al. Protease-activatedreceptor 2，a receptorinvolved in melanosome transfer，is upregulated in humanskin by ultraviolet irradiation [J]. The Journal of Investigative Dermatology，2001，117（6）：1412-1420.

[4] 胡益勇，徐曉玉.阿魏酸的化學和藥理研究進展[J].中成藥，2006，28（2）：253-255.

[5] 劉淑穎，駱丹.阿魏酸對UVB導致人角質形成細胞氧化損傷的保護作用研究[J].中國美容醫學，2009，18（8）：1102-1104.

[6] 金一瓊，陳周譚，賴富饒，等.曲酸與阿魏酸對酪氨酸酶的抑制作用研究[J].現代食品科技，2012，28（4）： 379-381 .

[7] Gong SZ，Cheng J，Yang ZR. Inhibitory effect of ferulic acid on oxidation of L-DOPA catalyzed by mushroom tyrosinase [J]. Chinese J Chem Eng，2005，13（6）：771-775.

[8] 陳景華，王興焱，王雪，等.當歸提取物對黑素瘤細胞與角質形成細胞共培養模型黑素合成的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（17）：205-208.

[9] 吳姍姍，許歡歡，朱丹丹，等.UVB輻射對黑色素細胞黑素合成及其相關基因表達的影響[J].新疆醫科大學學報，2016，39（4）：422-429.

[10] 王鷹，李海東，劉樹雷.NB-UVB對角質形成細胞和黑素細胞SCF、KIT、MITF表達的調控作用[J].重慶醫學，2012，41（2）：110-112.

[11] 姚蕾，鐘淑霞，蘭珊珊，等.黃芩苷聯合NB-UVB對黑素細胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響[J].吉林大學學報：醫學版，2014，40（5）：1024-1027.

[12] 賀中華.瑞爾黑變病皮損中C-KIT和PAR2表達水平研究[D].山西：山西醫科大學，2015.

[13] Steingrímsson E，Copeland NG，Jenkins NA. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network [J]. Annu Rev Genet，2004，38：365-411.

[14] 黎釗，王平，洪為松，等.正常人黑素細胞MITF 對酪氨酸酶相關蛋白的轉錄調控研究[J].醫學研究雜志，2013， 42（3）：58-62.

[15] 楊慧蘭，陳波，梁潔，等.復方中藥對小鼠B16 黑素瘤細胞酪氨酸酶與MITF mRNA 表達的調節[J].中國美容醫學，2009，118（110）：1477-1479.

[16] 趙光，楊文信.黑色素細胞的研究近況[J].西南軍醫，2013，15（2）：177-181.

[l7] 張春香，盛玉清.熊果苷和維生素C鈉對黑色素生成的抑制作用[J].江蘇藥學與臨床研究，2006，14（4）：220-222.

[18] 謝家寶，洪遜強，劉利利，等.色象中藥對人A375黑素瘤細胞酪氨酸酶活性的影響[J].陜西中醫，2011，32（3）：361-363.

[19] 畢建云，劉善新，靳光乾，等.阿魏酸透皮吸收研究綜述[J].中藥材，2013，36（6）：1028-1031.

[20] 劉艷紅，楊子佳，祝鈞.阿魏酸酯類衍生物的制備及其在化妝品中的應用[J].化學世界，2014，（11）：701-704.

（收稿日期：2016-11-09 本文編輯：蘇 暢）