一種物理調控的表達有機磷降解酶opdA智能基因工程菌的構建

劉一楊，趙方琳，儲金言，趙雪江，王秋雨

(1.遼寧省實驗中學 1715班,遼寧 沈陽 110841; 2.遼寧大學 生命科學院,遼寧 沈陽 110036)

一種物理調控的表達有機磷降解酶opdA智能基因工程菌的構建

劉一楊1，趙方琳1，儲金言1，趙雪江1，王秋雨2*

(1.遼寧省實驗中學 1715班,遼寧 沈陽 110841; 2.遼寧大學 生命科學院,遼寧 沈陽 110036)

針對有機磷農藥在環境和果蔬表面殘留日趨嚴重危害人體健康的問題，設計并構建一種可以通過物理條件控制的智能基因工程菌，該工程菌可在溫度敏感性RNA的調控下，在高于設定溫度條件下，表達有機磷農藥降解酶A并分泌到細胞外，降解環境中的有機磷農藥.并通過RecA(SOS)啟動子控制，經接收紫外光照射后啟動自殺程序，避免攜帶有抗生素抗性基因的工程菌擴散對環境造成影響.該設計可用于在外界環境或果蔬表面安全地進行有機磷農藥的清除，達到對有機磷農藥污染的環境修復和維護食品安全提供健康果蔬的目的.

表達載體；有機磷降解酶A；自殺基因ccdB；智能基因工程菌

0 引言

隨著我國農業生產的高速發展，農藥的使用量呈快速遞增趨勢.農藥的廣泛使用促進了農業生產發展，但過量施用農藥的大量殘留對生態環境和農產品也造成了嚴重污染，威脅著食品和生態安全，危害人民的身體健康.近年來，農藥殘留超標已經嚴重影響我國水果、蔬菜等農產品的產品質量，降低了我國農產品的國際市場競爭力，影響了我國農產品的出口貿易，不利于國民經濟增長和社會發展[1].在眾多農藥品種中，有機磷農藥(Organophosphorus Pesticides，OPs)是一種廣泛使用的殺蟲劑，約占全世界殺蟲劑使用量的34%[2]，有機磷農藥大多為磷酸酯或硫代磷酸酯類化合物，在水中的溶解性差，易溶于有機溶劑[3].

有機磷農藥種類很多,根據其毒性強弱分為高毒、中毒、低毒三類[4].高毒類有機磷農藥少量接觸即可中毒,低毒類大量進入體內亦可發生危害，一般濃度的有機磷農藥由消化道進入、呼吸道吸入或皮膚吸收，中毒癥狀重，發病急.如吸入大量或濃度過高的有機磷農藥，可在5分鐘內發病,迅速致死[5].據世界衛生組織統計，全世界每年至少發生50萬例有機磷農藥中毒事件，死亡11.5萬人[6].另外，約85%以上的癌癥、80余種疾病與有機磷農藥殘留有關[5-6].

有機磷農藥降解酶目前已被公認為是消除農藥殘留的最具潛力的新方法.目前，許多酶已經被鑒定出可用于降解有機磷酸酯農藥，其中來源于放射形土壤桿菌屬Agrobacterium radiobacter P230的有機磷降解酶(opdA)具有更加廣泛的底物與更高的酶催化效率[7,8].近年來，對有opdA酶結構和功能的研究取得了較大的進展，已經進入分子水平[9].這使得通過基因工程和蛋白工程改良opdA酶的性質，研制出符合不同應用領域要求的有機磷降解酶產品成為可能.

目前已經報道的opdA酶基因工程菌[10-11]，但多為胞內形式表達，需要破碎細胞壁進行提取，且表達過程中易形成包涵體，需要復雜的變性復性過程，只能用于制備粗酶制劑.并且，目前報道的基因工程菌在表達opdA酶的過程中需要添加化學誘導物，另外基因工程菌所含有的抗生素抗性基因也可能對環境造成影響[10,12]，不能直接用于環境的修復和果蔬的解毒實際應用.

本研究構建的有機磷降解酶opdA基因工程菌，可利用ompA分泌肽結構將表達的opdA酶蛋白分泌至宿主細胞外，以實現對環境中和果蔬表面有機磷農藥殘留的生物降解.為了控制opdA酶蛋白的表達，本研究引入了強啟動子控制下的RNA溫度計元件，當環境溫度低于32 ℃時opdA的表達被關閉，而當環境溫度上升至32 ℃以上時表達被啟動，避免了化學誘導物的使用.另外，為了控制具有抗生素抗性的基因工程菌在環境中的轉播，本文引入了RceA啟動子控制下的ccdB自殺基因，當菌體收到紫外光線照射時RecA被激活，ccdB自殺基因表達，可導致宿主菌死亡.

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌菌株DH5α，大腸桿菌菌株BL21(DE3)購自于天根生化科技(北京)有限公司；含opdA編碼基因的核酸片段1117369，含RceA(SOS)啟動子基因的核酸片段11200363購自于美國Integrated DNA Technology(IDT)公司，表達載體質粒pSB1K3由美國IGEM(International Genetically Engineered Machine Competition)組織惠贈.

1.1.2 試劑和工具酶

T4 DNA連接酶、Tag DNA聚合酶、Pyrobest DNA聚合酶、核酸限制性內切酶(EcoR I，Hind III，Spe I，Xba I和Pst I)、不同分子量DNA電泳Marker等均購自Takara大連公司；卡那霉素為Sigma公司產品；酵母提取物和胰蛋白胨購自OXOID公司、瓊脂糖膠回收試劑盒、質粒DNA提取試劑盒購于北京博大泰克生物技術有限公司；引物合成、DNA片段合成和DNA測序均由北京華大技術服務公司(BGI)完成；其他化學試劑均購自國藥集團的分析純試劑.

1.2 方法

1.2.1 表達及調控元件的基因結構設計

為了實現本研究的預期目標，本文所設計表達及調控元件的基因結構如圖1所示.

圖1 設計的表達及調控元件基因結構示意圖

本研究使用強啟動子啟動下游RNA的轉錄，當環境溫度低于32 ℃時，轉錄出來的溫度敏感RNA片段退火成環狀發夾結構，使核糖體RNA不能結合，翻譯過程被終止；而當環境溫度上升至32 ℃ 以上時，溫度敏感RNA片段舒展為線性結構，核糖體RNA可以結合，使得下游序列可以翻譯成為完整的目的蛋白質分子(ompA分泌肽連接opdA有機磷降解酶)；翻譯出的opdA有機磷降解酶蛋白在ompA分泌肽引導下可被轉運至宿主菌細胞外，降解宿主菌細胞外界環境中的有機磷農藥.降解完成后，在紫外線照射下，RecA啟動子被激活，啟動下游ccdB自殺基因的轉錄和表達，可導致宿主菌死亡，以阻止該工程菌在環境中的擴散.各表達及調控元件的基因序列如表1所示.

表1 各表達及調控元件的基因序列

1.2.2 DNA片段和PCR引物合成

按照設計，委托北京華大技術服務公司(BGI)合成兩個DNA片段，分別為:frag1片段(強啟動子+溫度敏感RNA+ompA基因)；frag4片段(ccdB編碼基因).本文中所用的全部PCR引物如表2所示.

表2 本文中所用的全部PCR引物序列

注下劃線部分為限制性核酸內切酶識別位點

1.2.3 各基因片段PCR擴增

利用各自的PCR特異性引物，使用相應的DNA模板，擴增出4個DNA片段.擴增各片段所用的引物及模板分配如表3所示.

表3 擴增各基因片段所用的PCR引物和模板

PCR反應體系為：10×Pyrobest DNA聚合酶 buffer 5 μL，Pyrobest DNA聚合酶 2 U，dNTP 250 μmol，上下游PCR引物各25 pmol，模板DNA 0.1 μg，無菌超純水補齊體積至50 μL.PCR反應條件為：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃不同時間(F1，F3和F4片段30 s；F2片段90 s)，30個循環；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存.各PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收純化各目的條帶.

1.2.4 第一輪片段連接

將以上切膠回收純化的4個PCR產物，經Hind III核酸限制性內切酶充分消化，再次經1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收純化.將純化后的F1和F2片段等摩爾比混合，在T4 DNA連接酶作用下充分連接過夜；以此連接產物為PCR模板，分別以F1-f和F2-r為上下游引物，以Pyrobest DNA聚合酶進行PCR反應；反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收純化約1 260 bp的目的條帶，即為F1+2片段.同樣方法，將純化后的F3和F4片段等摩爾比混合，在T4 DNA連接酶作用下充分連接過夜；以此連接產物為PCR模板，分別以F3-f和F4-r為上下游引物，以Pyrobest DNA聚合酶進行PCR反應；反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收純化約560 bp的目的條帶，即為F3+4片段.

1.2.5 第二輪片段連接

將以上切膠回收純化的F1+2片段的PCR產物，經Spe I核酸限制性內切酶充分消化，再次經1%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收純化；將以上切膠回收純化的F3+4片段的PCR產物，經Xba I核酸限制性內切酶充分消化，再次經1%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收純化.將純化后的F1+2片段和F3+4片段等摩爾比混合，在T4 DNA連接酶作用下充分連接過夜；以此連接產物為PCR模板，分別以F1-f和F4-r為上下游引物，以Pyrobest DNA聚合酶進行PCR反應；反應產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收純化約1 820 bp的目的條帶，即為F1+2+3+4片段.

1.2.6 連接表達載體

將以上切膠回收的F1+2+3+4片段，經EcoR I和Pst I雙核酸內切酶充分消化，并再次純化，純化產物與經同樣EcoR I和Pst I雙核酸內切酶處理的表達載體質粒pSB1K3片段，以摩爾比3∶1充分混合，并以T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接.連接產物通過CaCl2轉化法[6]轉入大腸桿菌菌株E.coliBL21(DE3)感受態細胞，經含有那卡霉素(60μg/mL)的LB平板過夜培養，然后挑取單克隆，并以引物F1-f和F4-r進行菌落PCR，PCR擴增參數：95 ℃變性5min；95 ℃30s，65 ℃ 30s，72 ℃90s，30個循環；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存.鑒定得到正確的重組子，經Sanger終止法測序進一步驗證后得到重組表達載體pSB1K3-F1+2+3+4.

2 結果

2.1 各片段的PCR擴增結果

根據各個片段序列設計的PCR引物，成功的對四個不同片段進行了PCR擴增(圖2)，其中F1片段(強啟動子+溫度敏感RNA+ompA基因)，F3片段(含RceA啟動子基因)，F4片段(含ccdB編碼基因)均表現出較高的擴增效率，并且只擴增出唯一的目的條帶，表明引物的特異性良好.而F2(含opdA編碼基因)片段的擴增產物中，出現了三條不同大小的條帶，說明引物與非目的序列之間存在一定程度的非特異性結合，經多次優化PCR反應條件，非目的條帶仍然存在，但長度為1 058 bp的目的條帶亮度非常明顯，為主要擴增產物，且與非目的條帶之間在1%濃度下的瓊脂糖凝膠電泳圖上相距較大距離，易于通過切膠回收的方式剝離純化出來.切膠回收純化后的產物再經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明各目的條帶獲得純化，且具有較高收率(圖3).

泳道1、11：DL2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；泳道2、3：片段F1的PCR擴增產物；泳道4、5：片段F3的PCR擴增產物；泳道6、7：片段F4的PCR擴增產物；泳道8：不添加模板DNA的F2陰性對照PCR擴增產物；泳道9、10：片段F2的PCR擴增產物.

圖2 4個片段的PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 第一輪片段連接結果

以F1片段和F2片段的連接產物為PCR模板，分別用F1片段的上游引物F1-f和F2片段的下游引物F2-r，成功擴增出長度約為1 260 bp的F1+2片段；同樣，以F3片段和F4片段的連接產物為PCR模板，分別用F3片段的上游引物F3-f和F4片段的下游引物F4-r，成功擴增出長度約為560 bp的F3+4片段.擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖4)，只呈現出一條目的條帶，無其他雜帶產生，說明特異性較好，擴增效率較高.

泳道1：片段F1的PCR擴增切膠回收產物；泳道2：片段F2的PCR擴增切膠回收產物；泳道3：片段F3的PCR擴增切膠回收產物；泳道4：片段F4的PCR擴增切膠回收產物；泳道5：DL 2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp).

圖3 4個片段的PCR擴增后的切膠回收

產物在1%瓊脂糖凝膠電泳圖 泳道1：DL2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；泳道2：片段F1+2的PCR擴增產物；泳道3：片段F3+4的PCR擴增產物.

2.3 第二輪片段連接結果

以F1+2片段和F3+4片段的連接產物為PCR模板，分別用F1片段的上游引物F1-f和F4片段的下游引物F4-r，成功擴增出長度約為1 820 bp的F1+2+3+4片段.擴增產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖5a)，發現除目的條帶外，還出現極少量片段長度較小的非目的條帶，但經切膠回收純化后，非目的條帶得到很好的去除，純化后的目的條帶純度較好(圖5b).

2.4 表達載體陽性克隆子的篩選結果

經EcoR I和Pst I雙酶切的F1+2+3+4片段，與經同樣雙酶切的表達載體質粒pSB1K3片段連接后，得到表達載體質粒pSB1K3-F1+2+3+4，轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞.18 h后，在含有那卡霉素(60 μg/ml)的LB平板中出現數十個菌落大小不等的陽性轉化子(圖6).為避免假陽性克隆，挑取菌落較大，邊緣整齊均一的菌落，以引物F1-f和F4-r進行菌落PCR驗證.經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，盡管有少量非特異性的雜帶，但挑取的菌落中均擴增到了亮度較高的 1 820 bp左右的目的條帶，與陽性對照一致(圖7)，說明獲得了正確的重組子.經Sanger終止法測序進一步驗證后得到重組表達載體pSB1K3-F1+2+3+4.

a.片段F1+2+3+4的PCR擴增產物：泳道1：DL2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；泳道2，3：片段F1+2+3+4的PCR擴增產物；泳道4：不含模板的陰性對照.b.片段F1+2+3+4的切膠回收產物：泳道1：DL2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；泳道2：片段F1+2+3+4的切膠回收產物.

圖5 片段F1+2+3+4的PCR擴增產物和切膠回收產物在0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖6 轉化有表達載體質粒pSB1K3-F1+2+3+4的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)在含有那卡霉素的LB平板上的陽性轉化子

泳道1和8：DL2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；泳道2-7：6個不同的克隆子分別的菌落PCR擴增產物；泳道9：陽性PCR對照；泳道10：陰性PCR對照.

圖7 菌落PCR篩選結果在0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

隨著有機磷農藥使用量的逐年上升，其造成的污染問題日趨嚴重，尤其是殘留在果蔬表面和自然界土壤、水體中的各類有機磷農藥，嚴重威脅人們的健康和生活質量.由于有機磷農藥多為脂溶性化合物，普通清水洗滌的去除效果有限，而以酯酶等對有機磷污染環境和果蔬進行降解和解毒，則是較為行之有效且最為環境友好的方式[24].

有機磷降解酶opdA通過水解有機磷農藥的磷脂鍵，最終實現有機磷農藥的無毒化.因其具有底物范圍廣和催化效率高的特點，被公認為最具有應用前景.目前已經有較多opdA酶用于基因工程化表達的報道，而以大腸桿菌為表達宿主菌的研究中，opdA酶均以包涵體的形式在細胞內表達，不能直接產生具有活性的opdA酶蛋白，這對實際應用造成限制[8].為了讓基因工程化的opdA酶表達到細胞外行使降解功效，本文采用了在opdA編碼基因上游添加ompA分泌信號肽[18]的方式，作為opdA酶基因工程胞外表達的引導肽.ompA是一種大腸桿菌分泌型信號肽，由21個氨基酸殘基組成，其中段由丙氨酸和異亮氨酸組成的核心疏水區，形成了一段α-螺旋結構，ompA分泌信號肽可引導融合在其下游表達的目的蛋白穿越細胞質膜，到達細胞外區域，實現胞外表達[25].

圖8 RNA Thermometer在低溫時形成的環狀發夾結構

在基因工程菌設計和構建中，為了避免目的基因過早的大量表達而對工程菌本身的生長造成影響，常以誘導型啟動子調控目的基因的表達.常用的化學誘導物如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、四環素等，即增加了誘導表達的成本，也不利于在環境和果蔬表面原位施用.本文中采用更為可行的物理調控方式，在編碼基因上游添加以強啟動子控制下的RNA溫度計(RNA Thermometer)元件[16]，該元件是一段溫度敏感型的非編碼RNA，在生物體熱休克或冷休克反應中調控相關基因的表達.其作用原理[16-17]是，在溫度低于閾值(32 ℃)時，該段RNA序列改變二級結構，形成環狀發夾(圖8)，隱藏起核糖體結合位點(RBS)，使宿主細胞核糖體不能結合，阻止了下游基因的翻譯；而當環境溫度高于閾值溫度，該段RNA序列舒展為線性，核糖體可以結合，翻譯被啟動.

作為基因工程菌最常用宿主菌的大腸桿菌，本身就是一種條件致病菌.另外，基因工程化的質粒中經常含有抗生素抗性篩選標記，使得構建好的基因工程菌具有抗生素抗性能力，在環境中擴散極易帶來生態風險，這是普通基因工程菌不能直接用于環境原位修復的主要限制因素之一.在大腸桿菌菌體收到紫外線照射時，就會啟動細菌基因組中RecA基因的轉錄表達，其表達產物為分子量38Kd的RecA蛋白，該蛋白可激活RecA(SOS)啟動子，啟動下游關于DNA修復基因的轉錄表達，該過程對于菌體基因組的損傷修復極為重要[19,21].ccdB基因[23]編碼一種大腸桿菌毒素蛋白CcdB，該蛋白可使細胞內的DNA促旋酶失活，從而殺傷宿主細胞.本文利用以上特性，在載體設計中采用RecA(SOS)啟動子調控下的ccdB自殺基因來人工控制該基因工程菌的存活.當降解完成，需要清除基因工程菌時，對菌體進行一定強度紫外線照射，啟動菌體基因組內RecA基因的轉錄表達，其表達產物RecA蛋白激活載體中的RecA(SOS)啟動子，啟動其下游的ccdB基因表達，其表達產物CcdB毒素蛋白使基因工程菌細胞內的DNA促旋酶失活，殺死該基因工程菌，實現人為控制下的自殺效應，避免該基因工程菌在環境中擴散所帶來的生態風險.

[1] 張秀玲.中國農產品農藥殘留成因與影響研究[D].無錫：江南大學,2013.

[2] SinghBK，WalkerA.Microbial degradation of organophosphoruscompounds[J].FEMS Microbiol Rev,2006,30：428-471.

[3] Murakami T,Iwamuro Y,Chinaka S,et al.Highly Sensitive Detection of Organophosphorus Pesticides Using 5,10,15,20-Tetrakis(4-hydroxyphenyl)porphyrin[J].Analytical Sciences,2015,12:1325-1328.

[4] Wu L P,Yao J,Trebse P,et al.Compound specific isotope analysis of organophosphorus pesticides[J].ChemoSphere,2014:458-463.

[5] BaoY,Zhang Ch X,Yang W B,et al.Mechanism and kinetics study on the OH-initiated oxidation of organophosphorus pesticide trichlorfon in atmosphere[J].Science of the Total Environment,2012:144-150.

[6] 趙敏,陳良宏,張志剛,等.有機磷農藥中毒機制和治療新進展[J].中國實用內科雜志,2014,11:1064-1068.

[7] Theriot C M,Grunden A M.Hydrolysis of organophosphorus compounds by microbial enzymes[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2011,1:35-43.

[8] 陳大超.有機磷降解酶基因(opdA)在大腸桿菌與枯草芽孢桿菌中的表達與酶學研究[D].上海：上海海洋大學,2013.

[9] Irene H,Xing H Q,DavidL,et al.Functional effects of amino acid substitutions within the large binding pocket of the phosphotriesteraseOpdA from Agrobacterium sp.P230[J].FEMS Microbiology Letters,2006：2592.

[10] A.R.SatvikIyengar,Rajan K.Tripathy,PriyankaBajaj,et al.Improving storage stability of recombinant organophosphorus hydrolase[J].Protein Expression and Purification,2015(111):28-35.

[11] Blatchford Paul A,Scott Colin,French Nigel,et al.Immobilization of organophosphohydrolaseOpdA from Agrobacterium radiobacter by overproduction at the surface of polyester inclusions inside engineered Escherichia coli[J].2012,5:1101-1108.

[12] 蔣建東,李榮,郭新強,等.多功能農藥降解基因工程菌株m-CDS-1環境釋放安全評價[J].微生物學報,2008,11:1479-1485.

[13] Schaerli Y,Gili M,Isalan M.A split intein T7 RNA polymerase for transcriptional AND-logic[J].Nucleit Acids Research,2014,19:12322-12328.

[14] Schlabach Michael R,Hu Jimmy K,Li Mamie,et al.Synthetic Design of Strong Promoters[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2010,6:2538-2543.

[15] Kaneko T,Nakamura Y,Sato S,et al.Complete genomic sequence of nitrogen-fixing symbiotic bacterium Bradyrhizobiumjaponicum USDA110[J].DNA Research,2002,6:189-197.

[16] Kortmann J,Narberhaus F.Bacterial RNA thermometers:molecular zippers and switches[J].Nature Reviews Miceobiology,2012,4:255-265.

[17] NeupertJuliane,Karcher Daniel,Bock Ralph.Design of simple synthetic RNA thermometers for temperature-controlled gene expression in Escherichia coli[J].Nucleic Acids Research,2008,19:e124-e124.

[18] Martinez E,Cantet F,Fava L,et al.Identification of OmpA,a Coxiellaburnetii Protein Involved in Host Cell Invasion,by Multi-Phenotypic High-Content Screening[J].Plos Pathogens,2014,3:e1004013.

[19] Nash JHE,Villegas A,Kropinski AM,et al.Genome sequence of adherent-invasive Escherichia coli and comparative genomic analysis with other E.coli pathotypes[J].Bmc Genomics,2010,1:667-667.

[20] Bonocora Richard P,Smith Carol,Lapierre Pascal,et al.Genome-Scale Mapping of Escherichia coli[sigma]54 Reveals Widespread,Conserved Intragenic Binding[J].Plos Genetics,2015,10：e1005552.

[21] Bell JasonC,Kowalczykowski Stephen C.RecA:Regulation and Mechanism of a Molecular Search Engine[J].Trends in Biochemical Sciences,2016,6:491-507.

[22] AmitRanjan,SabihaShaik,ArifHussain,et al.Genomic and Functional Portrait of a Highly Virulent,CTX-M-15-ProducingH30-Rx Subclone of Escherichia coli Sequence Type 131[J].2015,10:6087-6095.

[23] Lund BA,Leiros HKS,Bjerga GEK.A high-throughput,restriction-free cloning and screening strategy based on ccdB-gene replacement[J].Microbial Cell Factories,2014,1:38-38.

[24] 錢立立.農藥殘留的快速檢測和前處理技術的研究[D].合肥：中國科學技術大學,2007.

[25] Krishnan Subramanian,PrasadaraoNemani V.Outer membrane protein A and OprF:versatile roles in Gram-negative bacterial infections.[J].The FEBS Journal(Online),2012.

(責任編輯 李 超)

Construction of An Intelligent Genetically Rngineered Bacteria Expressing Organophosphate Degradation Enzyme Gene OpdA with Physical Regulation

LIU Yi-yang1,ZHAO Fang-lin1,CHU Jin-yan1,ZHAO Xue-jiang1,WANG Qiu-yu2*

(1.Class1715ofLiaoningProvinceExperimentalMiddelSchool,Shenyang110841,China; 2.LifeScienceSchoolofLiaoningUniversity,Shenyang110036,China)

For the increasingly serious problem that organophosphorus(OPs) pesticide residues in the environment and the surface of fruits and vegetables damage human health,we design and construct an intelligent genetically engineered bacteria that could be regulated by physical condition.With regulation of temperature-sensitive RNA,the intelligent genetically engineered bacteria would produce and secret organophosphate degradation enzyme opdA into the extracellular to degrade OPs pesticides in the environment,when it was higher than settled temperature.Meanwhile,under the control of RecA(SOS) promoter,this bacteria could start suicide program if exposed to UV,to avoid bringing adventure by spreading genetically engineered bacteria with antibiotic resistance genes for environment.This kind of bacteria could eliminate safely OPs pesticides residues in the environment and the surface of fruits and vegetables.As a result,it could repair environment polluted by OPs pesticides and maintain food safety with providing healthy fruits and vegetables.

expression vector;organophosphate degradation enzyme A;suicide gene ccdB;intelligent genetic engineering bacteria

2016-07-01

遼寧省科技廳基金項目(2015020654)

劉一楊(1999-) ，女，沈陽人，遼寧省實驗中學高二學生，《生命密碼》社團創始人之一.

*通訊作者：王秋雨(1961-) ，男，沈陽人,博士，教授，從事細胞分子生物學研究，E-mail:qiuyuwang@lnu.edu.cn.

Q 291

A

1000-5846(2017)01-0051-08